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3、eniszewski LC 20AProminence 液相色谱分离原理 液固 吸附 色谱液液 分配 色谱正相色谱反相色谱键合相色谱离子对色谱离子抑制色谱离子交换色谱空间排斥色谱亲和色谱 液相色谱分类 吸附色谱 分离机理 化合物在固定相表面吸附中心的竞争吸附 吸附色谱固定相极性酸性 硅胶 碱性 氧化镁 硅酸镁分子筛 三氧化二铝等 非极性 活性炭 流动相常使用烷烃为底剂 加入适当的极性调整剂 溶剂极性越大 洗脱能力越大 注意 不能使用含水的流动相 因为硅胶遇水会失活 微量水可改善拖尾状况 有时用水作减尾剂 吸附色谱 分离物质对中等分子量的油溶性样品可获得最佳分离 例如油品 脂肪 芳烃等对具有不同
4、极性取代基的化合物或异构体有较好的选择性但对于强极性或离子型的化合物会产生不可逆吸附 对同系物分离能力较差优点 样品负载能力大稳定性好 pH 3 8 吸附色谱 液液分配色谱 固定相 惰性载体上机械涂布固定液固定液容易流失 导致保留值减小 柱效下降 化学键合固定相已经逐步取代了液液色谱固定相 键合相色谱 正相液相色谱 正相液相色谱流动相极性小于固定相极性分离机制 范德华作用力的定向作用力 诱导作用力及氢键作用力 固定相 键合的胺基 NH2 腈基 CN 醚基 O 等氢键力 胺基 腈基 芳硝基 二醇基 醚基流动相 常使用烷烃为底剂 加入适当的极性调整剂 溶剂极性越大 洗脱能力越大分离物质 不溶于水
5、有机混合液的亲脂样品 异构体混合物和制备HPLC 胺基柱 极性强 具有碱性 可在酸性水溶液中作弱阴离子交换剂 分离酚 羧酸 核苷酸 与糖分子中的羟基作用 可分离单糖 二糖 多糖 注意 胺基柱不能分析含有羰基的化合物 如醛 酮 还原糖等 流动相不能用丙酮 键合相色谱 正相液相色谱 腈基柱 中等极性 分离选择性与硅胶类似 但保留值比硅胶低 对酸性 碱性样品可获得对称峰 对含双键的异构体或双键环状化合物有良好的分离能力 芳硝基柱 弱极性对芳香族化合物及多环芳烃有良好的分离选择性 键合相色谱 正相液相色谱 二醇基柱 弱极性可分离有机酸及其共聚物 也可以作为分离蛋白质的凝胶过滤色谱的固定相醚基柱 弱极性
6、可分离能形成氢键的化合物 如酚类和硝基化合物也可以作为分离蛋白质的凝胶过滤色谱的固定相 键合相色谱 正相液相色谱 反相液相色谱流动相极性大于固定相极性分离机制 疏水性 键合相色谱 反相液相色谱 反相液相色谱固定相 键合的烷基或苯基等非极性固定相流动相 水 有机溶剂 缓冲液键合相链越长 疏水性越强 溶质的保留值增大流动相表面张力越大 介电常数越大 极性越强 溶质与键合相的作用越强 流动相的洗脱能力越差 溶质保留值越大 溶质的极性越弱 疏水性越强 保留值越大 键合相色谱 反相液相色谱 分离物质 能溶于水 有机混合物的中性或非离子化合物烷基柱 C8 C18 可分离中等极性的化合物 溶于水的高极性化合
7、物 如 小肽 蛋白质 甾族化合物 类固醇 核碱 核苷 核苷酸 极性合成药物等苯基柱 C6H5 可分离非极性至中等极性的化合物 如 脂肪酸 甘油脂 多核芳烃 酯类 邻苯二甲酸酯 脂溶性维生素 甾族化合物 类固醇 PTH衍生化氨基酸等 键合相色谱 反相液相色谱 1 稳定性正相键合相的稳定性要小于反相键合相反相键合相使用pH为2 8 pH 8 5会引起基体硅胶溶解2 重现性同一种类型的键合相 因厂家不同 生产批号不同 会表现不同的分离特性 表现为重复性差3 键合相色谱柱的再生吸附 缔合等作用使柱效降低正相色谱柱再生 1 1甲醇 氯仿反相色谱柱再生 甲醇 丙酮 二甲基甲酰胺 0 01mol L无机酸
8、硫酸pH 2 键合相色谱 键合相使用的注意点 键合相色谱 流动相的选择 正相色谱 反相色谱 水 正相 反相色谱中溶剂选择性示意图 离子对色谱法原理离子对色谱法是将一种 或数种 与溶质离子电荷相反的离子 称对离子或反离子 加到流动相或固定相中 使其与溶质离子结合形成离子对 从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法 关于离子对色谱机理 至今仍不十分明确 已提出三种机理 离子对形成机理 离子交换机理 离子相互作用机理 键合相色谱 离子对色谱 常用离子对试剂季铵盐叔胺烷基磺酸盐高氯酸烷基硫酸盐 键合相色谱 离子对色谱 分析对象有机酸 碱 盐离子交换色谱法无法分离的离子和非离子混合物药物分析如生物碱 磺胺类
9、药物 某些抗生素 维生素 键合相色谱 离子对色谱 影响离子对色谱分离选择性的因素1 溶剂的极性2 离子强度 反相色谱中 离子强度增加 溶质k 值降低 正相色谱中 离子强度增加 溶质k 值增加 3 pH值 反相色谱中 pH值降低 阴离子溶质k 值降低 正相色谱中 pH值增加 阴离子溶质k 值增加 4 温度5 离子对试剂的性质和浓度的影响 键合相色谱 离子对色谱 离子抑制色谱通过向流动相中加入少量弱酸 常用醋酸 弱碱 常用氨水 或缓冲盐 常用磷酸盐和醋酸盐 调节流动相的pH值 增加组分在固定相中的溶解度 并改善峰形 以达到分离有机弱酸 弱碱的目的 键合相色谱 离子抑制色谱 影响离子抑制色谱分离选择
10、性的因素1 pH值 对于弱酸 pHpK值时 组分以离子形式存在 k值减小 对于弱碱 情况相反 2 温度3 离子抑制试剂的性质和浓度的影响 键合相色谱 离子抑制色谱 分离对象适合于3 08 0的碱 应采用离子对色谱法或离子交换色谱法离子抑制色谱缺点是重复性较差 键合相色谱 离子抑制色谱 键合相色谱 离子对色谱和离子抑制色谱的区别 1 添加物质不同离子抑制色谱法向流动相中添加抑制剂抑制自身解离 所添加的抑制剂为低分子有机或无机弱酸 弱碱 盐 抑制离子为样品本身具有的离子 离子对色谱法是向流动相中加入离子对试剂 离子对试剂为有机两性化合物 表面活性剂 2 分析对象不同离子抑制色谱法适于分离弱酸 弱碱
11、 有机盐 两性化合物 弱酸 弱碱与分子化合物共存时的分离离子对色谱法用于有机强酸 碱的分离 离子交换色谱法 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法 凡在溶液中能够电离的物质 通常都可用离子交换色谱法进行分离 它不仅适用无机离子混合物的分离 亦可用于有机物的分离 例如氨基酸 核酸 蛋白质等生物大分子 应用范围较广 1 离子交换原理离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的 其固定相采用离子交换树脂 树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子 当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换 其交换反应通式
12、如下 R A B R B A阳离子交换 离子交换色谱法 阴离子交换 对于典型的磺酸型阳离子交换树脂 一价离子的KB A值按以下顺序 Cs Rb K NH4 Na H Li 二价离子的顺序为 Ba2 Pb2 Sr2 Ca2 Cd2 Cu2 Zn2 Mg2 不同价离子 价态越高 选择性系数越大对于季铵型强碱阴离子交换树指 各阴离子的选择性顺序为 ClO4 I HS04 SCN NO2 Br CN Cl BrO3 OH HCO3 H2P04 IO3 CH3COO F 离子交换色谱法 离子交换色谱法 2 固定相作为固定相的离子交换剂 其基质大致有三大类 合成树脂 聚苯乙烯 纤维素和硅胶 而离子交换剂又
13、有阳离子和阴离子之分 再根据官能基的离解度大小还有强弱之分 3 流动相离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度 或离子强度 的缓冲溶液 通过改变流动相中盐离子的种类 浓度和pH值可控制k值 改变选择性 如果增加盐离子的浓度 则可降低样品离子的竞争吸附能力 从而降低其在固定相上的保留值 离子交换色谱法 阴离子的滞留次序为 柠檬酸离子 SO42 C2O42 I NO3 CrO42 Br SCN Cl HCOO CH3C00 OH F 用柠檬酸离子洗脱要比氟离子快 阳离子的滞留次序为 但差别不如阴离子明显 Ba2 Pb2 Ca2 Ni2 Cd2 Cu2 Co2 Zn2 Mg2 Ag Cs Rb
14、 K NH4 Na H Li 流动相电离度增大 就会使样品的保留增大 关于pH值的影响 要视不同情况而定 例如 分离有机酸和有机碱时 这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制 增大pH值会使酸的电离度增加 使碱的电离度减少 降低pH值 其结果相反 离子交换色谱法 离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法 由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制 例如 对于那些不能采用紫外检测器的被测离子 如采用电导检测器 由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测 为了解决这一问题 1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术 他们在
15、离子交换分离柱后加一根抑制柱 抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂 通过分离柱后的样品再经过抑制柱 使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相 从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量 这种色谱技术称为抑制型离子色谱 离子色谱法 若样品为阳离子 用无机酸作流动相 抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂 当试样经阳离子交换剂的分离往后 随流动相进入抑制柱 在抑制柱中发生两个重要反应 R OH H Cl R Cl H2OR OH M Cl M OH R Cl 由反应可见 经抑制柱后 一方面将大量酸转变为电导很小的水 消除了流动相本底电导的影响 同时 又将样品阳离子M 转变成相应的碱 由于O
16、H 离子的淌度为Cl 离子的2 6倍 提高了所测阳离子电导的检测灵敏度 对于阴离子样品也有相似的作用机理 离子色谱法 抑制型离子色谱仪 非抑制型离子色谱仪 离子色谱法 离子色谱法 抑制器技术的种类 76 81填充柱 再生液 81 85中空纤维85 92膜类型 抑制液 92 现在膜类型 电透析 岛津公司目前方式填充柱 电化再生 离子色谱法 膜类型 电透析 抑制器 离子色谱法 填充柱 电化再生 抑制器 NaHCO3 树脂 SO3 H 树脂 SO3 Na H2CO3 填充柱 固相化学抑制 1 带有10通阀的双抑制柱能提供连续进样分析 2 小体积的抑制柱使死体积更小电化学再生 1 不需要抑制液 不需额外填加泵 2 非常简单的更换抑制柱和维护简便且价格低 离子色谱法 填充柱 电化再生 抑制器 离子色谱法 抑制器 膜类型电透析填冲柱 固相化学抑制 用电化方法再生 shimadzu 优点缺点电透析 不需填加泵 高价格填充柱 不需填加泵 需要再生 低价格 亲和色谱法 AC 分离机制亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力 进行选择性分离的一种方法 它通常是在载体 无机或有机填料 表面先
