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1、培 训 课 件年月目 录.液相色谱的理论部分.液相色谱的操作部分（三聚氰胺的检测）.色谱柱的安装. 三聚氰胺检测卡的使用. 水解蛋白的检测.灰分的测定.马弗炉的使用.食品中蛋白质的测定仪器回收率的测定的使用 .塑化剂的检测一、高效液相色谱的理论部分一、 色谱定义1、 色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术。2、 流动相：携带样品流过整个系统的流体。3、 固定相：静止不动的一相，色谱柱。二、 色谱的分类1、 高效液相色谱。、气相色谱。、薄层色谱。、毛细管电泳。三、 色谱优点1、 同时分析。、分离性能好。、灵敏度高（）。、进样量小（）。四、 色谱要求1、 水：专门的纯水机或超纯水机，
2、理想的用水应为18.2M 超纯水，并通过的滤膜，除去热源、有机物、无机离子等。不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水。2、 有机溶剂：色谱纯，用前需要有机膜过滤，超声。3、 缓冲盐：水系膜过滤，超声，冷藏，易长菌。使用前后必需要用：的甲醇水过渡，不能直接使用纯有机溶剂。否则会造成腐蚀、磨损、阻塞等现象。使用前后，需要用纯水冲洗泵头清洗管路，易受细菌和霉菌的影响。4、 脱气（超声）：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡。泵中气泡使液流波动，改变保留时间各峰面积；柱中气泡使流动相绕流，峰变形；检测器中的气泡产生基线波动。五、 高压梯度洗脱：用两台高压输液泵将两种溶剂输入。避免分析时间长，分离度差，
3、在最短时间内获得最佳的分离。六、 柱温箱，我们设定的柱温为40，这样是为了分析结果重现性好，提高柱效，降低柱压，保证检测稳定性。七、 分析柱的维护1、 在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下（）冲洗，长时间未用的分析柱也要同样处理。2、 定期作用强溶剂冲洗柱子。3、 我们使用的流动相主要是缓冲盐，要先用：的甲醇水溶液冲洗，再用有机溶剂冲洗。4、 净化样品。5、 分离条件。6、 不使用时，要盖上盖子，避免固定相干涸。八、 紫外检测器，原理基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收。九、 我们现有这种方法最低检出限为，所以对于小于的低含量样品，我们只能做到定性检测。1、 色谱峰的定性鉴别 通过目标
4、物的保留时间进行定性，需要指定保留时间误差范围（时间窗、时间带）。2、 在相同的分析条件下 保留时间相同并不肯定是同样的组份，保留时间不同肯定不是同样的组份。3、 定性确认 仅仅通过保留时间并不能完全确证该物质，通过加入标准物确认，通过色谱条件确认，质谱联用也可以作为进一步确证的手段。十、外标法 是实验室常用的定量方法，定量结果准确。其特点： 、不需要所有峰都流出或被检测到，只对目标组分作校正。 、需要标准样品。 、进样量必须准确。 、仪器必须有良好的稳定性。十一、吸液过滤器清洗：用纯的异丙醇或的稀硝酸超声，超声清洗无效时，需要更换。检查吸滤器网眼堵塞的方法，取出过滤部分，记录压力波形。如果取
5、出后压力波形不正常，则吸滤器网眼堵塞。二、液相色谱操作部分液相色谱简易流程图溶剂输液泵进样器色谱柱检测器数据处理一、原理：试样用三氯乙酸溶液乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。二、试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为 规定的一级水。甲醇：色谱纯。乙腈：色谱纯。氨水：含量为。三氯乙酸：()准确称取10g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。柠檬酸。辛烷磺酸钠：色谱纯。离子对试剂缓冲溶液：准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约水溶解，调节至后，定容至1L备用。甲醇水溶液：准确量取甲醇和水混匀后，用有机系膜过滤，超声
6、半小时，备用。并在下一次用前需要再超声。氨化甲醇溶液（）：准确量取氨水和甲醇，混匀后备用。三聚氰胺标准品：，纯度大于。三聚氰胺标准储备液：准确称取（精确到）三聚氰胺标准品于容量瓶中，用甲醇水溶液（）溶解并定容至刻度，配制成浓度为的标准储备液，于4避光保存。阳离子交换固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为基本苯磺酸化的聚苯乙烯二乙烯基苯高聚物，填料质量为，体积为或相当者。使用前依次用甲醇、水活化。定性滤纸。氮气：纯度大于等于。微孔滤膜：,有机相。注：其中甲醇、乙腈、缓冲盐都需要过滤并超声（用有机系或水系膜过滤，超声半小时，并在下一次用前需要再超声）。甲醇水也要超声半小时，并在下一次用前需
7、要再超声。三、仪器和设备高效液相色谱（）仪：配有紫外检测器或二级管阵列检测器。分析天平：感量为0.0001g和0.01g。离心机：转速不低于。超声波水浴。固相萃取装置。氮气吹干仪。涡旋混合器。具塞塑料离心管：。振荡器。 四、样品前处理提取：称取2g（精确至0.01g）试样于具塞塑料离心管中，加入三氯乙酸溶液和乙腈，超声提取，再振荡提取后，以不低于离心。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至，移取滤液，加入水混匀后做待净化液。 净化：将步中的待净化液转移至已经活化的固相萃取柱中。依次用水和甲醇洗涤，抽至近干后，用氨化甲醇溶液洗脱。整个萃取过程流速不超过。洗脱液于50下用氮气吹
8、干，残留物（相当于0.4g样品）用流动相（也可以用水）定容，涡旋混合，用注射器吸出样品，然后拿下针头，慢慢的过微孔滤膜盖上样品瓶盖，并使样品瓶盖内的小胶垫有颜色的一面对着样品，轻轻带上盖子即可，不要把盖拧的太紧，把样品瓶放在样品架上相应的位置，供测定。五、实验具体操作步骤：1、 连接好各个电源，打开电脑，由下至上打开各个仪器开关以及自动进样器的开关。在画面上双击分析按钮，听到“吱、吱”的声音，表明电脑已经识别到各个连接部件，除柱温箱外（柱温箱的温度设定为40，温度要过几分钟才能升到），其它部件显示灯均应为绿色。2、 换上已经超声过的：的甲醇：水，依次把泵的旋钮按“逆时针”方向由原来的“竖直”位
9、置旋至“水平”位置，并分别按下两个泵的键，分钟后结束，再“顺时针”方向将两个泵的旋钮由“水平”位置旋至“竖直”位置。同时注入纯水，洗一下泵头。然后在实时分析状态下点击工具栏上的“仪器开关”按钮，修改参数，并点击“下载”。3、 第二步进行半小时后（也称洗脱半小时或过渡半小时），点击实时分析状态下工具栏上的“泵的开关”按钮，将泵关掉，换成做样所用的流动相。我们现在用色谱主要检测三聚氰胺，所用流动相为缓冲盐（辛烷磺酸钠柠檬酸）和乙腈。然后同样需要“”分钟，过程同步。然后，修改仪器参数，在正常状态下的简单设置里，找到泵的模式:二元高压梯度;总流速：泵的浓度：;检测器波长：;结束时间：;柱温箱温度：40
10、。然后起个文件名，找个位置把这个方法另存在一个你容易找到的位置。因为这个方法在后处理时我们要用它进行数据分析，然后点击“下载”，将信息传送给仪器。4、 一个小时后观察基线走平情况，若平，我们就可以做样了，不平就再多走一会。我们做样较多，我们就采用批处理的方法。首先，进行单次分析，做一个标准样，得到目标物质的保留时间，然后才能进行批处理。因为同一种目标物质的保留时间会随流动相和环境温度的不同而不同，所以每天做样都要重新做校准曲线。在实时分析中的数据采集状态下，点击助手栏中的“单次运行”，会弹出一个对话框，这里我们要添写上样品名称：某一浓度的标准样，数据文件：改为与你今天保存方法的文件夹一致的数据
11、文件；样品瓶号：与你所要单次运行的标准样相对应的瓶号数;进样体积：,点击“确定”。5、 单次运行结束后，我们双击中的“再解析”，打开数据分析状态，在数据文件中找到标准样，双击它，会在化合物表视图中看到一个表格，点一下结果，就会看到保留时间的数值。记下这个保留时间，下面执行批处理时会用到。6、 点击实时分析助手栏中的批处理，弹出一个表格，在这里，我们添写以下内容：样品瓶号：样品架上的瓶号是从号开始，我们就依次“向下填充”从开始至我们所需要的瓶号即可。样品名称：我们前五个都是标准样，我们就从第行开始填写样品名称。样品：对应的填写样品的批次。样品类型：在标准样的第一个空格里点下表格后面的小黑键头，出
12、来一个对话框，点下标准，初始化校准曲线，然后确定；第二个样准样到最后一个标准样都点击添加校准曲线级别。样品均写上未知样。方法文件：找到你保存的那个方法文件并打开它。数据文件：找到与方法文件相同的文件夹并写上标准样,在它的空格内点击详细信息，写上至行，未知样并在它的空格内点填加系列。级别:标准为至个级别，未知样均为。进样体积： 。点击左侧助手栏中的返回，再点“数据分析”，在此状态下点击菜单栏中的“方法”命令下的“数据分析参数”，弹出一个对话框，前面的几个参数看一下，都是设定所需要的参数，我们就不用管它，主要看一下“化合物表”这一项，添写保留时间，和五个级别的浓度值，浓度要由低到高的顺序。添写完后
13、，点击确定，并打开文件，点击另存批处理文件为，保存在今天的文件夹里。然后再点击批处理开始，进行批处理分析。7、 校准曲线：批处理，自动生成校准曲线。运行到第六针时，我们就可以在再解析状态下，打开数据文件，双击每一标准样，然后在它的图上点右键查看校准曲线信息，就能看到曲线的线性关系，至少为两个以上。8、 分析结束，我们打开再结析状态，查看结果并乘以稀释因子则是我们检测样品的最终结果。打开文件找到报告模板，把每一个样品的数据文件用鼠标左键拖到报告模板上，并打出报告，关闭再解析对话框。回到实时分析对话框，在菜单栏上关上泵，换上超声的：的甲醇：水，进行，同时注射器再注水，清洗泵头。如果第二天不需要做样
14、，甲醇水走半小时后，再换纯甲醇走半小时。六、要注意几点：第一，每一次换流动相，都要先关闭泵，要。结束后，一定要再打开泵。第二，换完流动相，要查看下吸滤头是否放在液面下，并要尽可能地把流动相的瓶口封好。第三，流动相要准备充分，实验中途不能添加，只能是更换超声重新走基线，比较繁琐。七、平常保养做好平常的保养可以有效的降低故障的发生率做好平常的保养可以延长仪器的使用寿命常做的保养()保证仪器的使用环境（经常清洁仪器，尤其是灰尘）()泵的保养（使用缓冲盐时要清洗柱塞，水和盐不要长期保存在泵里）（）进样器要经常清洗，避免污染物吸附或者堵塞管路（）色谱柱要定期清洗，保证柱效及使用寿命（）系统中不要长期保存
15、水和盐，长时间不用时应将仪器所有部分更换为以上的甲醇，避免细菌的滋生及盐的析出。八、吸滤头堵塞时表现为管路中不断有气泡生成，用异丙醇（或稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水清洗。三、液相色谱柱的安装 打开柱温箱，里面按色谱柱的位置标有箭头，与色谱柱上的箭头方向一致即可。拧下柱温箱内色谱柱两端的螺丝取下色谱柱，再打开封在新色谱柱两端的顶盖，小心地拧紧两端的螺丝，色谱柱的安装就完成了。 长时间不用仪器，应将柱子拿下来，堵上柱子两端，防止流动相干掉，保存在以上的甲醇溶剂里。四、三聚氰胺快速检测卡的说明及使用三聚氰胺快速检测卡用于定性、半定量检测样品中三聚氰胺残留，对于我们的奶粉检测限为。它的灵敏度达到。下面以奶粉为例讲述一下卡的使用。试样的处理，奶粉用纯净水按：稀释，一般溶解奶粉的水温需要度，用涡旋或手动强烈振荡分钟。然后使试样恢复室温。从包装袋中取出检测卡，打
