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1、临床检验中的发光免疫分析原理 优势和值得注意的问题 北京大学医学部研究员中国生物物理学会光生物学专业委员会副主任委员国际生物发光和化学发光学会 ISBC 学术理事CouncilmemberofscientificadvisoryboardofInternationalSocietyonBioluminescence Chemiluminescence 杨晓林 由于化学反应 通常是氧化 或生物化学反应产生电子能级处于激发态的物质 后者通过跃迁释放能量并产生光子 从而导致的发光现象 与荧光最大的区别在于无需激发光 因此后者也被称为光致发光 发光 Luminescence 化学发光 Chemilum
2、inescence 生物发光 Bioluminescence 生物发光和化学发光均属于冷光 即发光不是由于发光体温度升高所致 因此其反应能量绝大部分用于发光而不是发热 发射波长也与温度无关 发光测定属发射光谱分析 多采用动力 速率法或积分法 无需终止反应 也不受朗伯 比尔定律限制 而酶标显色测定属吸收光谱分析 多采用终点法 需终止反应 并受朗伯 比尔定律限制 按化学反应类型 化学发光的分类 酶促化学发光 辣根过氧化物酶系统碱性磷酸酶系统黄嘌呤氧化酶系统非酶促化学发光 吖啶酯系统草酸酯系统三价铁 鲁米诺系统 闪光 Flash 按发光持续时间 发光时间在数十分钟以上 如 HRP Luminol系统
3、AP AMPPD系统黄嘌呤氧化酶系统无须原位进样 以速率法测量 发光时间在数秒内 如吖啶酯以原位进样 InSituInjector 和时间积分法测量 辉光 Glow 时间 发光信号 辉光坪区 速率法测量 原位进样 积分法测量 闪光尖峰 闪光与辉光及其测量方式的差别 鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统 商业化产品中常见的化学发光系统 一 AMPPD及其衍生物的化学发光系统 光子 477nm AP O O OCH3 OPO32 O O O OCH3 商业化产品中常见的化学发光系统 二 商业化产品中常见的化学发光系统 三 吖啶酯化学发光系统 发光检测的剂量 反应关系曲线 信号强度 Y 实际曲线 标记
4、物浓度 X 理论 校正曲线 由于 不同发光体系和免疫分析模式具有不同的实际信号曲线因此 科学准确的特定校正技术是衡量设备和试剂匹配性的关键 发光信号检测 光敏二极管 光敏电池 光电偶合器 CCD 结构简单 性能稳定但灵敏度低 线性范围较窄 主要特点 原理 光信号 光电转换器件 电压或电流信号 放大 单光子计数器是目前高灵敏度发光分析仪的核心部件 光电倍增管 高压 高速放大器 高速比较器 高速分频器 发光样品产生光子 激发光阴极产生光电子 在阳极上形成较强信号 脉冲信号 相对发光单位数字脉冲 RLU 在各打拿极之间得到能量和数目的倍增 单光子计数器的工作特性 光子计数 Y 发光强度 X 饱和点
5、理论 校正曲线 实际计数曲线 由于 单光子计数是在检测随机光子事件因此 随光子数量增多检测效率持续下降所以 准确的校正技术是设备品质的关键 模拟 光电流 测量曲线 单光子计数式发光检测仪 计算机 打印机 发光仪控制模块 发光仪执行模块 控制器 程控高压 计数 贮存器 单光子计数器 样品运动 定位装置 程控自动门锁及检测装置 原位注射泵 光生物学技术的应用范围 军事侦测公安稽查卫生检疫药物筛查医学诊断环境检测航天遥感生命科学 已成为现代生物技术最活跃的领域之一 光生物学检测技术的优越性 彻底消除了放射性危害无半衰期限制 试剂稳定性和有效期大大延长容易实现连续 动态 重复测定 适合于复合标记系统进
6、行多指标并行测定操作简单 反应速度快 容易实现自动化灵敏度和线性范围超过以往技术 几种标记 检测技术理论极限灵敏度的比较 酶标 荧光 放免 发光 灵敏度 mol L 10 1810 1510 1210 9 几种标记 检测技术理论线性范围的比较 酶标 荧光 放免 发光 线性范围 105104103102 几种标记 检测试剂的有效期比较 酶标 荧光 放免 发光 有效期 月 1815129630 人民币 人民币 三种免疫测定技术的成本及费用 三种免疫测定技术的成本及费用 放免 酶标 发光 夹心法的剂量 反应关系曲线 信号强度 Y 线性范围 待测物浓度 X Hook 前滞 效应 分析灵敏度 最低检测限
7、 95 可信度 S0 2SD在该曲线上所对应的浓度值 功能灵敏度 测定误差 变异 20 的最低可检测浓度 线性范围 分析 功能灵敏度 变异 20 的最高检测浓度相关系数 0 99的曲线范围 竞争法的剂量 反应关系曲线 待测物浓度 X 信号强度 Y 线性范围 分析灵敏度 最低检测限 95 可信度 S0 2SD在该曲线上所对应的浓度值功能灵敏度 测定误差 变异 20 的最低可检测浓度线性范围 分析 功能灵敏度 变异 20 的最高检测浓度相关系数 0 99的曲线范围 发光免疫分析技术的现状及应注意的问题 商品化光生物学标记检测技术性能比较 化学发光 Chemiluminescence时间分辨荧光 也
8、称时间延迟光致发光 TimeResolvedFluorescence TimeDelayedPhotoluminescence 标记物为稀土元素络合物 通常采用解离增强荧光免疫分析 DEFIA 电化学发光 也称场致发光 Electrochemiluminescence Electroluminescence 标记物为稀土元素络合物 例如 电化学发光TSH检测试剂的分析灵敏度为0 005mIU L第四代化学发光TSH检测试剂的分析灵敏度为0 001mIU L原因在于抗体的亲合力 而不是检测技术 抗体筛选 干扰屏蔽 生产工艺 管理水平和技术服务是决定产品性能的关键 某些产品宣称的灵敏度远超过免疫反
9、应的理论极限 10 19mol L即 六个待测物分子 100ul样品 就发光分析而言 制约灵敏度的瓶颈在于抗体亲合力和干扰因素 而不是检测技术 所以 片面宣扬检测技术灵敏度和线性范围的强弱 不仅毫无意义 而且也是荒谬的 商品化发光免疫分析产品的某些宣传误区 C肽 胰岛素 免疫源性胰岛素 胰岛素 胰岛素原 真胰岛素 胰岛素 针对掩蔽性抗原 抗体选择 胰岛素 多抗或无选择性单抗 亚单位 亚单位 亚单位 普通HCG 亚单位 HCG 亚单位 亚单位 HCG游离亚单位 亚单位 X 抗体选择 HCG TSH PRL LH FSH类似 多抗或无选择性单抗 针对掩蔽性抗原 亚单位特异 亚单位特异 亚单位特异
10、亚单位特异 结合蛋白 PSA 总PSA PSA 游离PSA 抗体选择 游离PSA 针对掩蔽性抗原 针对非掩蔽性抗原与结合和游离PSA等分子结合 小分子性激素测定方法的进展 减少 结合蛋白类似物前体代谢产物 干扰 直接测定法 经典方法 消化样品 萃取有机相 分子筛柱分离各类甾体 测定 血清直接测定 高特异性单抗 结合蛋白屏蔽技术 男女性激素和皮质激素均来源于共同的前体和合成 代谢途径 其结构也非常相似 而且普遍与血清中的某些蛋白结合 因此 皮质功能紊乱 肝肾功能紊乱 某些遗传缺陷 血清蛋白异常 服用类固醇药物等均可造成这些激素测定结果的异常 游离甲状腺激素测定方法的进展 常见甲功指标 TSH F
11、T3 FT4 TT3 TT4对甲亢的诊断价值依次为 TSH FT3 FT4 TT3 TT4对甲低的诊断价值依次为 FT4 TSH TT4 FT3 TT3 但FT3 FT4灵敏度要求高 且易受干扰发光法提高了灵敏度 使得其临床应用普遍性超过TT4和TT3 两步法操作时间长灵敏度差准确性差 类似物法操作时间短灵敏度较好准确性较好 反向竞争法 标记抗体 操作时间短灵敏度更好准确性更好 第一代 放免 第二代 第三代 血清FT3 FT4试剂盒的发展 消除结合蛋白对测定的影响 测定游离激素的参考方法 金 标准 平衡透析法 透析液过多可导致测值偏高 操作复杂 采样量大 不适于临床常规 游离激素测定法的试金石
12、 稀释实验以游离T4为例 样品稀释20倍以内测值无明显变化 应扣除实验本身对样品的稀释度并注意基质效应 建议用6 8 BSA稀释 FT4 TBG K T4TBG 游离T4 游离结合蛋白 结合常数 结合T4 其中 K 由于绝大部分T4呈结合状态 因此 T4TBG TT4 总T4 TBG 总TBG TT4 故 K 所以 样品被稀释N倍后 T4TBG FT4 TBG TT4 FT4 总TBG TT4 固定常数 不变 TT4 K 总TBG TT4 TT4 NK 总TBG N TT4 N FT4 TT4 NK 总TBG TT4 N TT4 K 总TBG TT4 相同 即 FT4 发光技术 临床免疫分析划
13、时代的进步 以TSH 促甲状腺素 为例 第一代TSH检测试剂盒 普通放免功能灵敏度1 2mIU L基本无法测到正常值下限以下的血清TSH对甲亢的诊断意义不大 固相放免功能灵敏度0 1 0 2mIU L在甲亢的诊断中开始发挥作用 第二代TSH检测试剂盒 发光免疫功能灵敏度0 01 0 02mIU L成为甲亢诊断的首选指标之一 新型发光免疫功能灵敏度0 001 0 002mIU L更新了部分临床概念改写了甲功的调控理论 第三代TSH检测试剂盒 第四代TSH检测试剂盒 目前商品化发光免疫分析产品的几个特点 大多采用全自动工作方式 部分采用微孔板半自动方式多采用磁性或非磁性微粒包被 以增加表面积 使反
14、应时间缩短使用内建标准曲线加校正的办法产生工作曲线部分产品采用流动池测定方式 适合于闪光型发光或电化学发光 流动池检测方式示意图 检测器 检测池 负压泵 废液 四通阀 冲洗液 样品管 计量泵 干燥空气 原位进样泵 氧化剂 优点 结构简单 运行成本低缺点 易产生交叉污染 工作效率受限 标准化 自动化免疫分析系统对试剂盒的技术要求 对仪器的要求 结构简单 运行效率高 故障率低 维护费用少对试剂盒的相应要求 标准化 成套化 简单化 具体为 反应 洗涤 测定条件一致 操作步骤少且趋于一致反应时间短 通用成分多 专用成分少措施统一标记 检测系统重新优化并统一反应 洗涤 测定条件和操作步骤改变包被模式 微
15、粒包被 反应效率 反应时间 散射干扰 离子干扰 磁珠 间接包被 反应效率 反应时间 散射干扰 检测效率 注意内源性物质干扰 生物素 亲合素系统 微粒 间接包被 间接包被夹心法原理 包被体 待测抗原 间接包被物 标记抗体 俘获抗体 特点 所有试剂盒均采用同一包被物和结合配体 结合配体 工作曲线的特点与校正原理 工作曲线四要素拟合方式 描述曲线基本形状 取决于实验模式和剂量 效应关系走向 截距 描述曲线位置 修正依据为本底信号和系统误差 修正后导致曲线平移 斜率 描述曲线俯仰角度 修正依据为结合 反应 检测效率 修正后导致曲线旋转 变形因子 调整曲线形状 取决于抗体活性和特异干扰因素变化 信号强度
16、 Y 待测物浓度 X 基本形状 平移 旋转 变形 常见拟合方式的性质及其参数的含义 X 待测物浓度 Y 信号强度 Y0 零浓度样品信号强度 N 非特异结合信号强度 NSB 漂亮的拟合曲线决不是实验结果准确的唯一保证 定值 非定值质控血清才是监控数据可靠性的主要手段 谨防作弊软件 使用商品化发光免疫分析产品可能遇到的几个问题 与以往方法 放免等 在检测指标的正常值及临床意义上的差异 如 免疫源性胰岛素与真胰岛素 HCG 性激素等采用不同的单抗或多抗时检测结果也有较大差异 单抗特异性好 受干扰小 因此测值低 不同厂家产品测定结果之间一致性差 未与国家标准品比对 所使用的内建标准曲线结合校正的方法不尽完善 部分产品不显示原始数据 无法监控其准确性 免疫分析结果的干扰因素 温度 氧化剂 还原剂 光线 磁场 金属离子 防腐剂 杂质 本底物质 结合蛋白 测定小分子 同一干扰因素对不同检测方法的不同影响 待测物 包被 结合 抗体 放免法 免放或发光法 标记抗原 TBG 离心沉降 洗涤祛除 以甲状腺素结合蛋白 TBG 干扰竞争法测定T3为例 信号 结果 信号 结果 使用商品化发光免疫分析产品必须做好的
