《Illumina平台测序原理与常见测序文库构建》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Illumina平台测序原理与常见测序文库构建（64页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Illumina 平台测测序原理及常见见 几 种测测序文库库构建流程简简介 目 录录 第一部分 测测序测测序原理与流 程 简简介 文库库构建 6 hrs cBot HiSeq2500 MiSeq HiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx MiSeq HCS RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace 1 8 samples 1 8 samples DNA Illumina 测测序流 程 文库库构建 6 hrs cBot HiSeq2500 1 8 samples MiSeq HiSeq2000 HiSeq2500 1 8 samples GA IIx MiSeq HC
2、S RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace DNA 文库库构建流 程 片段化 DNA 末端补补平 3 加A 接头连头连接 PCR 高质量DNA文库结 构 文库构建的目的是在目的DNA片段两端都连接上想 要 的接头 此单链部分与 FlowCell表面上P7接 头相同 此单链部分与 FlowCell表面上P5接 头相同 Index Sequencing Primer 文库库构建 6 hrs cBot HiSeq2500 MiSeq 1 8 samples HiSeq2000 HiSeq2500 1 8 samples GA IIx MiSeq HCS RTA ICS MSR CA
3、SAVA BaseSpace 测序芯片 Flow Cell 简 介 flow cell是有2个或8个泳道 Lane 的 玻璃片 与一元硬币的厚度相当 每个泳道 Lane 内的上下两个表面 随机的布满了能够与文库两端接头 分别互补配对的寡核苷酸 oligos P7 和P5接头 在flow cell上进行cluster簇生成 仪仪器简简 介 单单条 DNA 模 板 约约1000条 DNA模板的 拷贝贝 cBotHiSeq Sequen ncceerr 35个循环的桥式 PCR cBot 工作流程 DNA文库变 性 使用NaOH将双链DNA文库变 性为单 链 模板链杂 交 将单链 DNA模板杂交到F
4、low Cell 上 第一链合成 以Flow Cell 表面上的oligos为引物 合成第一链 桥式PCR 冲走单链 DNA模板 以合成的第一 链 为模板进行35循环的桥式 PCR 线性化 将与P5接头连 接的DNA链从Flow Cell 上去 除 阻断3 OH 防止在后续测 序过程中继续 延伸DNA 链 杂交测序引 物 DNA模板杂交和一链合 成 接头头序列 5 3 延伸 含有P7和P5两种接 头 的FlowCell表面 单链 DNA分子与FlowCell 表面的对应 接头杂 交 以杂交的单链 DNA为模板 FlowCell上的接头为引 物 合成第一链 新合成的 链 原始模板 链 双链DNA
5、变 性 丢丢弃原始模板 链链 模板链被冲洗 走 新合成的链留在FlowCell 上 桥式PCR扩 增 单链 DNA与FlowCell表面对应 接头 杂 交 形成 桥 以接头为引物进行扩 增 桥式PCR扩 增 变 性 变性双链的 桥 得到与FlowCell相连的两条互 补 的单链DNA分子 第二轮桥式PCR扩 增 完成桥式PCR扩 增 完成28循环的桥式 PCR 线性 化 双链 桥 变性为单 链 红色箭头为 P5接头上 的 切割位点 线性 化 切割并冲走与P5接头相连的 那 条DNA链 阻断 阻断3 OH 杂交Read 1 引 物 Read1 测序引 物 将测序引物杂交到文库的接头 上 Illu
6、mina 测测序流 程 HiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx MiSeq HCS RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace 文库库构建 6 hrs cBot HiSeq2500 1 8 samples MiSeq 1 8 samples 进行Read1 测序 杂交Index 测序引物 进行Index 测序 Paired End Turnround 合成Read1互补 链 杂交Read 2 测序引物 进行Read 2 测序 HiSeq SBS 测序流 程 HiSeq SBS 测序流 程 1 2 3 Paired End Turnaround Sequencing
7、By Synthesis SBS测序原理 4种 Fl NTP s 聚合酶 拍照 收集信号 去阻断 切除荧荧光基 团团 X 36 151 可逆终止化学反 应 一次加入4种修饰的dNTP 可逆终止子 准确度高 可以得到同聚物序列 合成 照相 收集信号 去阻断 切除 荧 光基团 下一个碱基合成 100 Microns Clusters 已完成测序合成的片 段 Blocked 3 ends 变性掉已完成测序合成 的 片段 恢复被阻断的3 OH Paired End Turnround 形成的 桥桥 5 3 延伸 桥式 PCR 5 3 延伸 Paired End Turnround 形成的双 链链的桥桥
8、 Paired End Turnround 模板 链链 Paired End Turnround 等温变性 完成15轮桥 式 PCR后 进行线性化 将 模 板链切除 保留新合成 的子 链 新合成的 链链 3 OH阻 断 Read2测测序引 物 Paired End Turnround 线性化 3 OH阻断 杂交Read2测序引 物 Sequencing By Synthesis 2nd Read X 36 151 4种 Fl NTP s 聚 合酶 拍照 收集信号 去阻断 切除荧荧光基 团团 Illumina 测测序流 程 HCS RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace 文库库
9、构建 6 hrs cBot HiSeq2500 1 8 samples MiSeq HiSeq2000 HiSeq2500 1 8 samples GA IIx MiSeq 第二部分 常见见文库库构建流程 简简 介 文库分 类 DNA类类文库库 DNA小片段文库 DNA大片段文库 Exon文库 PCR Free文库 简化基因组文库 单细 胞样 本 文库等 RNA类类文库库 转录组 文库 表达谱 RNA Seq Small RNA DNA小片段文 库库 DNA小片段文库 片段大小在1Kb以下的普通DNA文库 200bp 350bp 500bp DNA小片段文库可用来进行人重测测序 动动植物 微生
10、物的de novo和重测测序 16s rRNA测测序 宏基因组测组测 序等项目类型的文库构建 DNA小片段建库流 程 DNA小片段建库流 程 DNA小片段建库流 程 DNA小片段建库流 程 DNA大片段文 库库 DNA大片段文库 又名末端配对 mate paired 文库 片段长度大于1K bp 主要用于动动植物 微生物的de novo 测测序 DNA大片段文库建库流 程 DNA大片段文库建库流 程 为为什么要建大片段文 库库 Exon文 库 人类外显子组总 共约30Mb 占全 部人类基因组约 1 外显子具有高度的保守型 且大部 分疾病的致病位点位于外显子区 外显子测序是指利用序列捕获技术 将
11、外显子区域DNA捕捉并富集后 进行高通量测序的基因组分析方法 Exon文库主要用于人全外显显子测测 序 和目标标区域测测序 Exon文库流 程 外显子捕获方 式 液相杂杂交 液相杂交是通过在溶液中 利用链碱基配对的原理 将DNA片段与探针杂 交 然后洗脱 富集目的 片段 Exon测测序特 点 优点 1 与全基因组测 序相比 外 显子测序具有测序覆盖度更深 数据准确性更高 花费成本更 低 等优势 对研究已知基因的 SNP Indel等具有较大的优势 不足 1 与全基因组测序相比 不 能 检测 到基因组内较大的结 构性 变异 2 与转录组测 序相比 不能 检 测到新的基因 PCR Free文 库库
12、 PCR Free文库 顾名思义 就是在文库构建 过 程中不需要进行PCR的文库 主要是针对一些特殊样本 比如GC含量高 PCR扩增困难的样本 PCR产物 不足 所需的样本起始量较多 PCR Free文库与普通文库比 较 简简化基因组组 RAD seq 文 库库 RAD seq 即基于酶切的简化基因组测序技术 是指利用 限制性内切酶对基因组进行酶切 结合一定大小的插入 片 段文库 对其进行高通量测序 快速鉴定高准确性的 变异 标记 SNPs 信息的技术 与传统技术相比 该类技术操作简单 不受参考基因组 限 制 可简化复杂基因组 另外 基于SNPs 的分子标 记技 术性价比高 稳定性好 在基因组
13、中分布更加广泛 特别 是适合大样本量的分析 简简化基因组组文库库建库库流 程 转录组转录组 文 库库 真核生物原核生物 总总 RNA 利用Oligo dT 富 集mRNA 去除 rRNA 随机引物六聚体反转转 录录合成cDNA 末端修复 加A 加 接头头后PCR扩扩增 Illumina 测测序 将mRNA 随机打断成 200 nt 转录组测 序的研究 对 象为特定细胞在 某一 功能状态下所 能转录 出来的所有 mRNA 应用 转录本的种类和基 因 定量 基因的转录结 构 可变剪切 发现新的转录本 链链特异性转录组转录组 建 库库 使用ssRNA seq可以确定转录本是来自正链还是负链 以 便更
14、加准确的获得基因的结构以及基因表达信息 并 且发 现新的基因 很多基因组区域具有正负链的转录本 反义转录 是真核 基 因的一个特征 是一种重要的调控方式 常规转录组 建库方法基 础上 在合成第二条 cDNA链时 替换dTTP 为dUTP 加上接头后 降 解含dU的DNA单链 链链特异性转录组转录组 建 库库 均一化 DSN 建 库库 方法 构建常规转录组 文库 库检合格后取80 100ng文库进行DSN 处 理 然后PCR再次出库 目的 减低高丰度表达基因 有效富集低丰度表达基因 DSN酶 双链特异性核酸酶 Duplex Specific Nuclease DSN 能够选 择性降解双链DNA和
15、DNA RNA杂交体中的DNA 由于高丰度的基因 形 成双链的速度较快 所以降解也比较多 RNA Seq 是用来研究某一生 物对象在特定生 物 过程中基因表 达差 异的技术 具有定 量准 可 重复性高 检测范围宽 成 本低等特点 真核生物原核生物 总总 RNA 利用Oligo dT 富集 mRNA 去除 rRNA 随机引物六聚体反转录转录 合 成cDNA 末端修复 加A 加接头头后 PCR扩扩增 Illumina 测测序 将mRNA 随机打断成 200 nt RNA Seq 与常规转录组规转录组 区 别别 RNA Seq转录组转录组 应用用于基因表达丰度 检测 用于拼接 1G 数据量 测序类型SE 50 8PE 91 8 91 建库方法 全程磁珠纯化切胶回收 插入片段弥散 主峰250 330 单一条带 Small RNA 文 库库 18 30nt范围内的RNA 结构上5 端主要以尿嘧啶开始 与mRNA的降解 翻译抑制 基因沉默 以及形 成异染色质有关 调控细胞生长 发育 基因转录和翻译等生物 过程 包括siRNA microRNA和piRNA Small RNA 文库建库流 程 谢谢 欢迎一起讨论 知识回顾知识回顾 Knowledge Knowledge ReviewReview 祝您成功
