第十三章临床微生物学检验与抗菌药物敏感性试验进展

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1、本章主要学习内容和要求主要学习内容要求基本概念细菌的耐药性检测临床常见的耐药菌株掌握第十三章临床微生物学检验与抗菌药物敏感性试验进展 IFI的实验诊断方法及临床意义熟悉了解标本的采集方法返回上一页下一页第一节概述一现代感染性疾病的特点感染性疾病 infectiousdiseases 是指各种生物性病原病原微生物寄生虫寄生人体所引起的传染性感染疾病和非传染性感染疾病一疾病谱发生变迁发现了很多引起传染病的新病原体如嗜肺军团菌汉坦病毒埃博拉病毒尼巴病毒朊病毒 SARS冠状病毒等而且已经绝迹的旧传染病又死灰复燃如梅毒结核病霍乱等二多重耐药

2、株的出现导致抗感染治疗的困难三器官移植抗肿瘤化疗和放疗的开展减弱了机体的免疫防御功能造成医院感染及条件性致病菌感染的增加上一页下一页返回二感染性疾病的实验诊断方法一一般实验室检查1 血常规检查2 C反应蛋白 CRP 3 降钙素原 PCT PCT是严重细菌性炎症和真菌感染的特异性指标而且也是脓毒症和炎症活动有关的多脏器衰竭的可靠指标如果给予足够的刺激免疫抑制的患者将产生PCT PCT不仅是用于鉴别诊断的急性指标而且是监控炎症活动的参数二病原学实验诊断感染性疾病的病原体的实验诊断方法包括病原体的分离培养病原体特异性抗原抗体的检测病原体核酸检测等多种方法上

3、一页下一页返回第二节细菌感染的实验诊断一标本的采集与培养方法一标本采集原则 1 采集标本时应无菌操作尽量避免污染盛放标本的容器和培养基应预先进行无菌处理并贴好标签 2 应选择感染部位或病变明显的部位采集标本避免周围组织器官或分泌物中的杂菌污染 3 根据病原体在感染性疾病的不同时期的体内分布和排出部位选择在最佳时间采集适宜标本 4 对于怀疑细菌感染的标本尽量在抗生素使用前采集 5 标本采集后应及时送检大多数细菌标本应冷藏送检但是某些细菌如脑膜炎奈瑟菌对低温和干燥极其敏感应注意保温尽量床旁接种并预温相应的培养基上一页下一页返回二常用标本的采集及培养方法

4、1 血液血培养是用于检测细菌真菌等患者血液中的微生物的方法 1 采血时机通常细菌从感染部位入血1小时后引起机体发热因此如果能够准确预测病人发热时间时在发热前半小时至一小时采血最好当无法准确预测病人发热时间时可在发热时采血细菌性心内膜炎患者可随时采血 2 采血量成人每次每瓶最好采血8 10ml 小儿每次每瓶可采血1 5ml 3 采血次数成人每天采血2 3次通常间隔半小时或1小时在患者不同部位采血 4 培养方法通常每次将血液分别加入需氧和厌氧两种培养瓶中35 C同时进行培养每天观察结果 3天后如果无菌生长则报告培养48小时无菌生长 7天后如果无菌生长则报告培养7天

5、无菌生长上一页下一页返回 2 尿液正常人体内膀胱中的尿液是无菌的尿液经尿道排出时受尿道细菌的污染而会混有细菌但取中段尿时细菌数不会超过103CFU ml 1 标本采集清洁外阴部位用无菌容器留取中段尿10ml 2 培养方法尿液一定要做定量培养通常取1ul或10ul尿液进行培养报告时要报告1ml尿液中的菌落数当取1ul尿液培养后发现无菌生长要报告小于1000CFU ml 3 结果解释通常引起泌尿系统感染的细菌有大肠埃希菌肺炎克雷伯氏菌等肠杆菌科细菌及肠球菌等革兰氏阳性球菌 90 以上的泌尿系统感染为单一细菌感染只有很少量患者为两种混合细菌感染当培养出三种以上

6、的细菌时可视为标本污染当培养出大于105CFU ml的细菌时通常认为可能是尿路感染或肾盂肾炎当培养出104 105CFU ml的细菌时诊断不确定当培养出小于103CFU ml的细菌时通常认为是标本污染上一页下一页返回 3 脑脊液中枢神经系统的感染有很多原因化脓性脑炎主要是由细菌真菌等引起偶尔也由寄生虫引起 1 标本采集按先后顺序取3管脑脊液每管2 5ml 1号试管细菌检查 2号试管生化学或血清学检查 3号试管细胞计数等常规检查 2 革兰氏染色检查有助于迅速查出肺炎链球菌或流感嗜血杆菌等细菌性感染 3 培养方法将脑脊液1500转离心15分钟取沉渣进行培养

7、5 CO2环境 35 C培养3天上一页下一页返回 4 痰正常人体的下呼吸道是无菌的留取痰标本时由于经常混入上呼吸道的分泌物通常痰培养时总是可以见到上呼吸道的正常菌群因此判断下呼吸道中是否有致病菌必须了解上呼吸道的正常菌群留取的痰标本的质量也直接影响培养的结果根据痰涂片革兰氏染色的结果可以判断痰标本的质量培养方法将痰液进行洗净均质化处理后接种于血平板巧克力平板麦康凯平板痰中的致病菌不少属于条件致病菌与正常菌群同时存在在培养报告中应作说明通常以报告草绿色链球菌和奈瑟氏菌为正常菌群的指标同时要注明相应菌群的量上一页下一页返回 5 浓汁组织或器官的化脓性感

8、染其病原菌的来源可分为两类内源性和外源性内源性的感染源是炎症局部周围器官中的正常菌群由于损伤等因素造成正常栖居菌进入无菌状态的组织内发生感染外源性的感染源是存在于人体外部自然界的微生物由于外伤和直接接触外界微生物通过人体表面进入人体造成感染 1 革兰氏染色涂片检查直接涂片可迅速为临床提供最初的诊断依据对淋病奈瑟菌产气荚膜梭菌等的诊断有意义 2 培养与鉴定通常将标本接种于血平板麦康凯平板巧克力平板等三种培养基疑为厌氧菌感染时还要接种厌氧血平板 3 对于无菌部位的感染从分泌物中分离的细菌一般都有临床意义按分离鉴定的菌种报告细菌名称及药敏实验结果上一页下一页

9、返回 6 便正常人体的肠道中栖居大量的微生物组成人体健康极为重要的体内微生态环境参与营养消化吸收等作用腹泻是因病原菌在肠道内大量繁殖的结果培养方法粪便中最常见的病原菌是沙门氏菌与志贺氏菌因此通常临床标本可接种SS平板即可如疑为特殊菌种感染要选择相应的选择性培养基如霍乱弧菌选用TCBS 小肠结肠炎耶尔森氏菌选用NYE琼脂平板或CIN琼脂平板难辨梭状芽孢杆菌选用CCFA琼脂平板念珠菌选用TTC沙保罗等 7 穿刺液穿刺液包括胸水腹水心包液关节液及鞘膜液正常的穿刺液是无菌的有感染的情况下只要检出细菌通常都可视为是病原菌因此革兰氏染色直接涂片检查很有意义只要检

10、出细菌即可诊断感染的类型培养须做需氧与厌氧培养而且要同时接种肉汤做增菌培养根据分离鉴定的细菌选择相应的药敏实验进行报告上一页下一页返回二细菌感染的实验诊断方法一显微镜检查直接显微镜检查是细菌感染实验诊断的基本方法之一包括染色和不染色标本检查法染色法可根据镜下细菌的形态及染色性做出初步诊断只对特定样品中的细菌有诊断价值 1 革兰染色革兰染色是诊断细菌感染最简单快速的方法通常根据不同的染色性和细菌形态可以对细菌的种属做出初步的推测性鉴定 2 抗酸染色鉴定结核和麻风等分枝杆菌属细菌的重要方法 3 墨汁染色用于检查脑脊液的隐球菌具有方便快速节约成本等优点 4 不染色

11、标本直接检查法主要用于检查细菌的动力及运动状态上一页下一页返回上一页下一页返回二病原菌的分离培养1 很多细菌的形态和染色性缺乏明显特征仅凭形态学不能做确切的诊断需经细菌的分离培养甚至纯培养后对细菌进行生化和血清学鉴定方能明确感染的细菌 2 原则上应对所有送检标本做分离培养以便获得单个菌落后进行纯培养从而对细菌做进一步的生物学免疫学致病性或细菌的药物敏感性等方面的检查最终做出确切的报告 3 细菌培养时应选择适宜的培养基以便提供特定细菌生长所需的必要条件分离培养后根据菌落的大小形态颜色表面性状透明度和溶血性等对细菌做出初步的识别然后根据生化反应结果

12、及血清学试验对分离菌做出鉴定上一页下一页返回三病原菌抗体的检测1 病原菌侵入机体后其抗原性物质能刺激机体产生特异性抗体存在于血液或其他体液中的特异性抗体常随病程的进展发生变化用已知细菌或其抗原检测病人体内是否产生了相应的特异性抗体及其量的多少可作为某些病原菌感染的辅助诊断 2 常用的血清学试验包括玻片或试管凝集试验沉淀试验补体结合试验和冷凝集试验等可根据病原菌的种类加以选择血清学诊断一般适用于病程较长和抗原性较强的病原菌引起的感染 3 若以血清学试验结果作为诊断依据时应在急性期和恢复期各取一份血清同时检测恢复期血清效价明显升高4倍或以上时方有诊断价值 4 用血

13、清学试验检测特异性抗体对感染性疾病的诊断有两方面的局限在疾病的早期抗体难以检测出来因此难以作为早期诊断的依椐当抗体水平升高时很难找出抗体效价与病情之间的关系上一页下一页返回四病原菌抗原的检测抗原的检测是用已知的特异性抗体检测未知的细菌抗原成分这些试验特异敏感简便即使是在采集样品前患者使用了抗生素对细菌的培养不易成功但细菌的抗原仍能被检测出来因此抗原的检测是检查病原菌的常用技术可直接使用临床标本或在细菌分离培养后进行上一页下一页返回五病原菌的核酸检测1 传统的微生物学鉴定技术主要根据微生物形态学和生化等表型特征来进行但有些试验耗时长费用高或难以顺

14、利完成随着分子生物学技术的发展多种检测病原菌核酸的实验技术已经被建立这不但能有助于感染性疾病的确诊还能确定病原菌的基因型使微生物学的检测技术从细菌生物学检查进展到细菌分子生物学的鉴定 2 分子生物学诊断技术常用于检测不能在体外培养或目前的培养技术不敏感费用高昂或耗时长的病原体目前常用的方法主要有聚合酶链反应 polymerasechainreaction PCR 及核酸杂交技术 nucleotidehybridization 包括Southern印迹杂交 Southernblot Northem印迹杂交 Northernblot 斑点杂交 dotblot 和原位杂交 insitu

15、hybridization ISH 等上一页下一页返回六内毒素检测1 细菌内毒素检查法又称鲎试验法它是1964年由美国学者Levih和Bang发现并在1968年正式建立的一种定性或定量检测微量细菌内毒素的分析方法该法具有灵敏度高特异性强和操作简便快捷的特点不仅在药学而且在微生物学及临床检验等领域应用较为广泛 2 鲎试验法可广泛用于革兰氏阴性菌感染的快速诊断可对患者的血液尿液及脑脊液进行直接检查有助于临床医生及时发现内毒素疾病以迅速采取果断的治疗在公共卫生方面鲎试验法可对水源食物饮料等进行内毒素测定以便将其控制在规定水平以下预防疾病 3 正常人血中内毒素

16、浓度为 0 1EU ml 超过此值即可诊断为内毒素血症许多研究表明内毒素与多种疾病密切相关内毒素血症多随病情恶化而加重随病情缓解而减轻因此内毒素可以作为一个衡量病情和判断预后的参考指标也可用于临床治疗及判定疗效或筛选恰当药物的指标之一上一页下一页返回第三节细菌的耐药性检测一细菌耐药性的概念细菌耐药性 drugresistance 是指细菌对某抗菌药物的相对抵抗性指病原体对反复应用的化学治疗药物敏感性降低或消失的现象上一页下一页返回第三节细菌的耐药性检测二细菌耐药性的遗传机制一天然耐药指细菌对某些抗菌药物的天然耐药耐药基因源自亲代由细菌染色体基因决定而且代代相传的耐药性存在于其染色体上具有种属特异性天然耐药性始终如一并可预测二获得耐药获得耐药性指细菌DNA的改变导致其获得耐药性表型耐药细菌的耐药基因来源于基因突变或获得新的基因作用方式为接合转导或转化可发生于染色体DNA 质粒转座子等结构基因也可发生于某些调节基因获得耐药性大多由质粒介导但也有染色体介导如金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药耐药基因在质粒转座子和整合子

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