卵黄抗体生产与应用技术

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1、卵黄抗体生产及应用技术进展卵黄抗体生产及应用技术进展 李建涛李建涛 20032003年年6 6月月 内容 一 生产技术 二 应用技术 三 问题及展望 一 生产技术 一 IgY产生过程 二 IgY转移时间 产量及影响产量的因素 三 IgY结构特点 四 IgY相对与IgG的优势 五 IgY纯化 活性测定及保存 一 IgY产生过程 1 腔上囊是禽类特有的控制体液免疫的淋巴器官 2 腔上囊中B细胞受到抗原刺激后分化成浆细胞 后者 分泌抗体进入血液 3 通过血液循环和输卵管上皮层分泌滤泡 产蛋鸡将母 源抗体选择性分泌到卵黄内 4 卵黄中Ig主要是IgG 叫IgY IgM和IgA转移到蛋清中 5 小鸡通过

2、IgY实现获得性被动免疫 猪 牛 马属通过初乳 兔 通过胎盘 6 卵黄中含有多种不同抗体 约200种 滴度取决于暴露程度 M Coleman 2000 7 用某种病原菌免疫母鸡 可产生特异性IgY Sugita 等 1996 用26种甲醛灭活病原菌免疫产蛋鸡 IgY 可预防多种疾病 二 IgY转移时间 产量及影响产量的因 素 1 用HI ELISA ID检查卵黄中IgY 抗体应答形成时间 晚于血清1 2周 Theresa H P 1985 鸭腺病毒 以后与 血清测得的HI滴度一致 也有报道卵黄卵黄抗体具有 累积作用 2 经加强免疫 卵黄中特异性IgY效价能维持数月奶至1 年 3 一个卵黄约含1

3、00 400 mgIgY 一只产蛋鸡每年可获 得40 50gIgY D Carlander 2002 相当与30只家兔同期 内血清IgG 产量 4 卵黄中抗原特异性抗体数量占IgY平均10 范围是5 抗胰岛素抗体 28 抗鼠IgG抗体 取决于免疫个体 免 疫程序及抗原的免疫原性 续 2 5 影响IgY产量的因素包括 1 抗原的质与量 颗粒 可溶性抗原 类毒素 菌体抗原 活菌 死菌 免疫麻痹 高免疫原性和安全 2 机体方面 A包括产蛋鸡品种 来航鸡 洛岛红鸡及其杂交后代 的特异性IgY最高平均浓度有显著差异 D Carlander 2002 B产蛋率和产蛋 间歇与IgY浓度 C蛋重及卵黄重 D营

4、养影响免疫系统发育 免疫 机能状况和生产性能 E健康状况 SPF鸡群 起码应无免疫抑制 性疾病和垂直传播性疾病 对父母代IBD的免疫 3 免疫途径 免疫程序 佐剂 续 3 6 生产卵黄抗体典型的免疫程序 Li Chan等 2000 1 首免 胸肌注射0 5 1mg 羽弗氏完全佐剂等体积乳 化抗原 2 首免后第3 5 7和25周用弗氏不完全佐剂乳化抗原 进行2 4次加强免疫 剂量逐步放大1 2倍 这种多 次注射加强剂量的抗原使之产生较高自动获得性免疫 的过程 称之为 超免疫作用 三 IgY结构特点 1 分子量160 180kDa 稍大于IgG 160kDa 2 多一稳定区而少一铰链区 铰链区有较

5、多脯氨酸 具 有韧性 与抗体分子构型变化有关 续 1 这种差异没有影响IgY的抗原 抗体结合特性和结 合能力 结合价也是2 Warr等 1995 然而对于pH 温度及蛋白水解等引起构象变化的环境条件 IgY比 IgG稳定 由于缺乏铰链区 两个抗原结合片段 Fab 紧密 排列 使IgY缺少韧性及功能种类 在确定条件下沉淀 及聚合反应能力降低 Warr等 1995 这使其具有 抵抗幼龄动物胃酸屏障的能力 3 IgY能介导过敏反应 与哺乳动物的IgE相似 四 IgY相对IgG的优势 1 高度保守的哺乳动物蛋白质对禽有较强的免疫原性 且产生有效 免疫反应所需抗原量小 Danielpour D 1993

6、 如IGF 1 且免 疫应答快 2 免疫反应具有交叉性 血缘越近 交叉反应程度越高 由于结构 上差异 IgY 与IgG几乎没有交叉免疫反应 减少了非特异结合和 假阳性 减少非特异性结合使免疫学检测灵敏性提高 达50 3 IgY具有较强的抗热 抗酸 抗离子强度和一定的抗酶分解能力 相对于IgG 提纯后IgY在合适条件储存10年滴度没有损失 Olovson等 1993 幼畜可以口服 经保护处理后成年动物也可 以口服 提纯后可以肌注 孙希琪 1995 4 USDA和FDA认为卵黄抗体是GRAS generally regarded as safe 且已允许商业生产用于人 续 1 5 符合动物福利原则

7、 因此 IgY具有可规模生产 成本低 特异性抗体 含量高 安全性好等优点 比实验室条件下通过实验 动物制备有限的高免血清更有实用性 五 IgY纯化 活性测定及保存 1 鸡蛋储存在 4 条件下6个月IgY活性损失很小 用做 食品和饲料添加剂 或兽医临床上 IgY多以全卵黄或 其水溶液的形式直接利用 或制成干粉利用 2 用于诊断分析或纯化生物活性分子 或在人医临床上 则需要提高IgY纯度或提纯特异性IgY IgY纯化分三步 第一步是粗提 将含有IgY的水溶性蛋白与水不溶的脂类和脂蛋白 分离 即除去脂质 方法有超滤 有机溶剂萃取 以及PEG SDS 沉淀脂蛋白等 经粗提的上清液或水溶液中IgY含量占

8、蛋白质的 15 第二步用硫酸葡聚糖钠等进一步沉淀 提纯出纯度大于80 的IgY 此时的IgY要低温或冻干保存 续 1 第三步是精提法 使用凝胶渗透层析 阴离子交换层析或超滤方法 进一步纯化 获得纯度96 99 的IgY 3 Akita等建立的水稀释法 先在微酸条件下用水稀释卵 黄 分离出卵黄蛋白 再用盐析 超滤 乙醇沉淀 凝胶过滤等进一步纯化IgY 4 特异性抗体采用亲合色谱法纯化 离子交换层析法浓 缩 或用免疫亲合法直接从水溶液中提取 5 普洛玛格公司的卵黄抗体纯化系统 Promega s EGGstract IgY 提供了快速和简易的IgY分离方法 该系统能在约1小时内提取2 5mg ml

9、纯度75 的IgY 续 2 6 提纯方法的选择取决于IgY产量 纯度 费用要求和技 术水平 7 常用ELISA测定IgY活性 8 提纯后抗体冷冻或冻干保存 50 w v 蔗糖能在热 酸和高压等加工条件下阻止IgY变性 在不能冷藏或 在加工过程中保护IgY活性 9 对提纯的IgY进行微胶囊化处理能显著增强起抗胃蛋 白酶和胃酸的能力 二 IgY应用技术 IgY上述优势及其对病原菌感染的防御无动物种属差 异使其在传染病的预防 诊断及治疗 免疫抗体监测 免疫分析 酶联分析以及做为功能食品因子和抗生素替 代品都很有用 特别是用鸡高免卵黄抗体防治其他动物 和人的肠道疾病 内容 一 在家禽中的应用 二 在水

10、产养殖中的应用 三 对仔猪和犊牛腹泻的防治 四 在奶牛上的应用 五 在人医上的应用 一 在家禽中的应用 1 目前国内应用卵黄抗体防治的禽病有传染性法氏囊 鸡新城疫 鸭病毒性肝炎 小鹅瘟 番鸭细小病毒 鸡减蛋综合征等 2 用IgY治疗IBD和ND混合感染 3 抗沙门氏菌LPS特异IgY阻止禽蛋和禽肉中沙门氏菌粘 附 控制其增殖上发挥明显作用 H H Sunwoo等 2000 4 IgY对雏鸡传染病的预防有独到优点 用于紧急预防接 种见效快 5 IgY代替血清抗体对禽传染病做出诊断和疫苗免疫后抗 体水平监测 二 在水产养殖中的应用 1 通过饲料用IgY治疗鳗鱼爱德华氏菌症 三 IgY对仔猪和犊牛腹

11、泻的防治 1 幼龄动物消化系统尚未发育完全 吸收初乳的同时口服特异性IgY 保护作用将显著增强 这方面应用最多的是对仔猪大肠杆菌及仔 猪 羔羊轮状病毒腹泻的治疗 2 大肠杆菌导致仔猪腹泻及抗大肠杆菌菌毛IgY阻止其在小肠粘膜上 附着 体外粘着抑制试验支持这一假设 Yokoyama等 1992 3 李国平等 2002 证明 仔猪出生后头36小时内口服IgY不被分解 和注射效果无差异 卵黄抗体与菌毛抗原的亲和力远远超过母乳 及高免血清中抗体与抗原的亲和力 对控制此病极为有利 4 如分离自家病原制备IgY用于本猪场腹泻防治 更有针对性 其效 果优于抗生素 续 1 5 卵黄抗体治疗仔猪黄痢的效果 肖驰

12、 1997 注 与其它三组相比 差异极显著 p 0 005 6 人工攻毒试验证明 含特异性牛冠状病毒 BCV 或产 毒素大肠杆菌的卵黄和初乳具有类似防治犊牛腹泻的 效果 组别治疗数治愈数治愈率 卵黄抗体 庆大霉素 土霉素 痢特灵 131 68 57 33 128 53 45 23 97 71 77 94 78 95 69 69 四 IgY在奶牛上的应用 1 乳房炎给奶业带来巨大损失 在美国 1992年乳房炎 造成十亿美元损失 3 SCC是衡量乳房感染与否及感染程度的指标 主要病原 是葡萄球菌和链球菌 4 日粮中特异性抗葡萄球菌和链球菌IgY显著降低了SCC 5 IgY给量与产奶量和奶中无脂固型

13、物增加相关 6 M Coleman 2000推测 IgY酶解片段 Fab 含9 11个 氨基酸 可能不再降解而被吸收进入血液 仍能在循 环中发挥活性作用 五 IgY在人医上的应用 1 通过口服病原特异性抗体建立人被动免疫保护 特别是对于胃肠 道抗原 鸡蛋是正常的食物组成 口服IgY没有毒副作用的风险 是人们喜欢的口服免疫治疗物品 2 用抗链球菌卵黄抗体漱口能减少链球菌在牙齿珐琅质上的定居 Hatta H等 1997 有效预防龋齿 3 虽然可以通过遗传工程设计出HIV颗粒的许多抗原决定簇 由于 HIV不断变异 使抗HIV抗原决定簇的单克隆治疗AIDS病人缺乏长 期效果 IgY是多抗 能同时识别几

14、个位点 提高了结合HIV颗粒 的机会 使免疫系统除去HIV 4 卵黄抗体保护免疫抑制病人或治疗先天性免疫缺陷患儿 5 IgY作为分泌型IgA的替代物 为免疫抑制病人内脏表面提供保护 续 1 6 与抗生素相比 IgY不会产生抗药性 是安全 有效 廉价的方式 人医上用IgY预防小儿病毒性腹泻已取得 理想的结果 开发功能性食品 三 问题及展望 1 现代免疫技术 最新生化分离技术 鸡蛋的工业化加 工综合利用技术相结合生产卵黄抗体是解决我国鸡蛋 生产供大于求 提高蛋鸡附加值有效措施 2 IgY作为一种经济有效的生产多克隆抗体 PcAb 的方 法 多种病毒 霉形体 棘球绦虫 酶 激素 Ig 动物毒素等的特异性IgY已成功制备 罗函禄 1997 3 经济 高效的分离纯化技术是关键 4 缺点及需要解决的问题 5 发展趋势 知识回顾知识回顾 Knowledge Knowledge ReviewReview 祝您成功