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1、第三章 蛋白质定位的 方法 第二节 利用绿色荧光蛋白融合蛋 白法定位蛋白质的方法 学生姓名 刘栋 导师 陈育新 本节课的主要内容 l蛋白质定位 l绿色荧光蛋白 l绿色荧光蛋白融合蛋白的构建 l绿色荧光蛋白融合蛋白的检测 l其它荧光蛋白简介 蛋白质定位 l真核细胞具有复杂的亚细胞结构 每种细胞器都有一 组特定的蛋白 l真核细胞除叶绿体 线粒体能少量合成蛋白外 绝大 部分蛋白是在胞浆或糙面内质网合成 最终运至不同 地点 形成成熟的蛋白质并行使功能 l译产物中很大一部分是以前体蛋白形式存在 往往有 蛋白分子定位信号 可引导蛋白质在胞内定位 l蛋白质在细胞内的定位问题 是细胞生物学研究的中 心问题 也
2、是分子生物学研究的热门话题 理解某些 蛋白质的定位从而分析探索其生物学功能 意义重大 蛋白质定位 蛋白质的亚细胞定位常用方法 蔗糖密度梯度离心 免疫胶体金标记 免疫荧 光 与GFP构建融合基因表达融合蛋白 多糖 序列分析等 绿色荧光蛋白 green fluorescent protein GFP l2008年诺贝尔化学奖 lGFP的结构特点 lGFP的发光机理 lGFP的荧光特性 lGFP的优点 lGFP的改进 lGFP的应用 2008年诺贝尔化学奖 日裔美国科学家 下村修 美国科学家 马丁 查尔非 美国华裔科学家 钱永健 诺贝尔奖委员会将化学奖授予美籍日裔科学家下村修 美国科学家马丁 沙 尔
3、菲和美籍华裔科学家钱永健三人 以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋 白质技术 2008年诺贝尔化学奖 l下村修 于1962年在水母Aequorea victoria发现 并分离得到GFP 并发现该蛋白在紫外线下会 发出明亮的绿色 l马丁 查尔菲 证明了GFP作为多种生物学现 象的发光遗传标记的价值 这一技术被广泛运 用于生理学和医学等领域 l钱永健 让人们理解了GFP发出荧光的机制 同时拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色 使得同一时刻跟踪多个不同的生物学过程成 为现实 GFP的结构特点 一级结构 lGFP由238个氨基酸残基组成 分子量为26 9kD lGFP的生色团位于氨基酸序列64 69位
4、lGFP的第65 66 67位氨基酸分别是丝氨酸 脱氢酪氨酸 甘氨酸 为构成GFP生色团的核 心 GFP的结构特点 空间结构特点 l由 11 条 桶状结构 barrel 绕成的一个圆柱体 直径约3nm 长约4nm l一条 螺旋缠绕在圆柱体的 轴位置 l生色团附着在 螺旋上 几 乎完美地包埋于圆柱体中心 l这种方式被称为 罐 can 晶体结构 GFP的发光机理 GFP的生色团是GFP发出荧光的物质基础 实质 由第65 66 67位的丝氨酸 脱水酪氨酸 甘氨酸 形成对羟苯甲基咪唑环酮 GFP的荧光特性 lGFP的最大吸收峰为 395nm 紫外 并有一个 479nm的副峰 蓝光 发 射光谱最大峰值为
5、 509nm 绿光 l尽管450 490nm 蓝光 是GFP的副吸收峰 但 由于长波能量低 细胞 忍受能力强 因此更适 合于活体检测 GFP的荧光特性 lGFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐 FITC 很相似 因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样 适用于GFP观察 l GFP荧光极其稳定 在激发光照射下的抗光漂白能力 比荧光素强 特别在450 490nm蓝光波长下更稳定 lGFP需要在氧化状态下产生荧光 强还原剂能使GFP 转变为非荧光形式 但一旦重新暴露在空气或氧气中 GFP荧光便立即得到恢复 而一些弱还原剂并不影 响GFP荧光 中度氧化剂对GFP荧光影响也不大 如 生物材料的固
6、定 脱水剂戊二酸或甲醛等 GFP的荧光特性 通过对GFP的结构和生化特性进行改造 已获得许多 具有不同发射峰和激发峰的突变体 使GFP的荧光强 度和作为报告基因的检测灵敏度大大提高 项目激发峰发射峰 野生型 wt GFP 红移突变体RSGFP 黄绿突变体YGFP 蓝色突变体BFP 增强型突变体OGFP 半衰期短的突变体 395 471 490 513 385 385 488 509 502 511 527 445 510 507 GFP及其主要突变体的荧光特征 nm GFP的优点 l易于检测 l荧光稳定 l无毒害 l通用性 l易于构建载体 l可进行活细胞定时定位观察 l易于得到突变体 GFP的
7、改进 尽管GFP作为报告基因或分子探针有许多无可 比拟的优点 但是野生型GFP wt GFP 具有 一定的缺点 lGFP有两个激发峰影响了其特异性 并且长波 激发峰强度较小 不易观察 lGFP合成及折叠产生荧光的过程慢 蛋白质折 叠受温度影响大 表达量较低 lGFP在某些植物细胞中并不表达 GFP的改进 l除去GFP基因中隐蔽型内含子 l消除编码蛋白的积累 l将GFP定位到特定细胞器中 l改变碱基组分 l更换GFP生色团氨基酸 l插入植物内含子 l增加增强子和更换强启动子 GFP的应用 l l 蛋白质定位蛋白质定位 l作为报告基因 l药物筛选 l融合抗体 l生物传感器 l其他方面 GFP融合蛋
8、白的构建 应用亚克隆技术 将目的基因与GFP基因构成 融合基因 通过愈伤组织转化法 基因枪 显 微注射 电激转化等方法转化到合适的细胞 利用目的基因的基因表达调控机制 如启动子 和信号序列来控制融合基因的表达 最终得到 融合蛋白 可以研究目的蛋白的定位 目的基因 gfp 基因 融合基因转化表达检测 GFP融合蛋白的构建 最关键的就是 要尽可能的不影响目的蛋白的定 位和功能 具体蛋白要具体分析 将目的基因与gfp基因融合有以下几种方式 l将gfp置于目的基因后面 即目的基因 gfp l将gfp置于目的基因前面 即gfp 目的基因 GFP融合蛋白的构建 注意事项 l两个基因之间用Linker连接
9、l在两个基因交接处可以增加一段核苷酸 3的倍数 如增加几个为甘氨酸或赖氨酸等编码的三核苷酸 目 的是使得两个基因的蛋白产物的空间结构相互影响较 小 有利于GFP发光 l前一基因必须要有起始密码 而不能带有终止密码 后一基因要保证有终止密码 l构建了融合基因后 必须测序进行验证 确保融合基 因读框正确之后才能进行后续研究 以免浪费人力 物力和宝贵的时间 GFP融合蛋白的检测 l定性检测 可以用常规的落射荧光显微镜或者 共聚焦显微镜观察 定量检测 免疫印迹法 酶联免疫吸附法 l可以在活细胞中进行图像分析 也可以检测固 定细胞中的GFP GFP融合蛋白的检测 注意事项 l以gfp作为报告基因研究蛋白
10、亚细胞定位 必 须做对照 由于某些细胞本身也有自发荧光 必须识别自发荧光与GFP的绿色荧光 以免假 象干扰实验 避免得出错误结论 l并不是所有的构建正确的融合基因都能正常表 达 因此要尽可能多的获得转基因细胞 如果 数目较少 可能会检测不到荧光 其它荧光蛋白简介 根据发射光谱 荧光蛋白有以下类型 几乎跨越整个可见光谱 lBFPs 440 470 nm lCFPs 471 500 nm lGFPs 501 520 nm lYFPs 521 550 nm lOFPs 551 575 nm lRFPs 576 610 nm lFRFPs 611 660 nm 参考文献 1 崔志芳 邹玉红 季爱云 绿
11、色荧光蛋白研究三个里程碑 2008年诺贝尔化学 奖简 J Chinese Joural of Nature 2008 30 6 324 328 2 徐飞虎 龚兴国 绿色荧光蛋白应用研究进展 J 细胞生物学杂志 2002 24 6 332 334 3 岳莉莉 齐义鹏 绿色荧光蛋白 现代细胞生物学与分子生物学研究领域的 新标记物 J 生物工程进展 1997 17 4 40 45 4 张敬之 郭歆冰 谢书阳等 用慢病毒载体介导产生绿色荧光蛋白 GFP 转基 因小鼠 J 自然科学 2006 16 5 571 577 5 Elena Popova Brit Rentzsch Michael Bader Generation and characterization of a GFP transgenic rat line for embryological research J 2008 17 955 963 6 夏玉凤 以gfp为报告基因研究蛋白亚细胞定位 J 生物技术通报 2006 2 11 13 7 胡建广 尹艳 GFP与微管结合蛋白和肌动蛋白结合区融合蛋白载体构建与 表达 J 2004 24 1 53 56 That s all Thank you
