荧光光谱原理与应用

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1、荧光光谱的原理与应用 主要内容 2 荧光光谱的基本原理 1 荧光光谱仪的原理 操作及数据处理 2 荧光光谱的应用 3 参考资料 4 荧光光谱的基本原理 3 4 荧光定义 荧光是辐射跃迁的一种 是物质从激发态失活到多重性相同的低能 状态时所释放的辐射 5 构造原理 电子在原子或分子中排布所遵循的规则 基态和激发态 能量最低原理 泡利不相容原理 洪特规则 基态 当一个分子中的所有电子的排布都遵从构造原理 时 此分子被称为处于基态 激发态 当一个分子中的电子排布不完全遵从构造原理 时 此分子被称为处于激发态 6 电子激发态的多重度 M 2S 1 S为电子自旋量子数的代数和 0或1 电子激发态的多重度

2、 根据洪特规则 平行自旋比成对自旋稳定 三重态能级比相应单重态能级 低 大多数有机分子的基态处于单重态 7 分子能级比原子能级复杂 在每个电子能级上 都存在振动 转动能级 分子能级与跃迁 激发 基态 S0 激发态 S1 S2激发态振动能级 吸收 特定频率的辐射 量子化 跃迁一次到位 失活 激发态 基态 多种途径和方式 见能级图 速 度最快 激发态寿命最短的途径占优势 第一 第二 电子激发单重态 S1 S2 第一 第二 电子激发三重态 T1 T2 8 雅布隆斯基分子能级图 S 2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 系间窜越 内转换 振动弛豫 能 量 2 1 3 外转换 2

3、 T2 内转换 振动弛豫 9 跃迁规则 跃迁前后原子核的构型没有发生改变 跃迁过程中电子自旋没有 改变 跃迁前后电子的轨道在空间有较大的重叠和轨道的对映性 发生了改变的跃迁是允许的 跃迁过程中电子自旋发生了改变 跃迁前后电子的轨道在空间不 重叠或轨道的对映性未发生改变的跃迁是禁阻的 Franck Condon原理 在电子跃迁完成的瞬间 分子中原子核的构型是来不及改 变的 10 电子处于激发态是不稳定状态 容易返回基态 在这个过程中通过 辐射跃迁 发光 和无辐射跃迁等方式失去能量 这个过程就称为失活 失活途径 辐射跃迁 荧光磷光内转换外转换系间窜越振动弛豫 无辐射跃迁 激发态停留时间短 返回速度

4、快的途径 发生的几率大 失活的途径 11 振动弛豫 同一电子能级内以热能量交换形式由高振 动能级至低相邻振动能级间的跃迁 发生振动弛豫的时 间一般为10 12 s 无辐射跃迁失活的途径 通过内转换和振动弛豫 高激发单重态的电子跃回第一 激发单重态的最低振动能级 内转换 多重度相同的电子能级中等能级间的无辐射 能级跃迁 12 无辐射跃迁失活的途径 系间窜越 不同多重态 有重叠的转动能级间的非辐射跃迁 改变电子自旋 禁阻跃迁 通过自旋 轨道耦合进行 外转换 激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转 移能量的非辐射跃迁 外转换使荧光或磷光减弱或 猝灭 13 荧光发射 电子由第一激发单重态的最低振

5、动能级 基态 多为 S1 S0跃迁 发射波长为 2的荧光 10 7 10 9 s 辐射跃迁失活的途径 磷光发射 电子由第一激发三重态的最低振动能级 基态 多为 T1 S0跃迁 发射波长为 3 的磷光 10 4 100 s 电子由 S0 进入 T1 的可能过程 S0 T1禁阻跃迁 S0 激发 振动弛豫 内转换 系间窜越 振动弛豫 T1 发光速度很慢 光照停止后 可持续一段时间 由图可见 发射荧光的能量比分子吸收的能量小 波长长 2 2 1 14 激发谱 固定发射波长 一般将其固定于发射波段中感兴趣的峰位 扫描 出的化合物的发射光强 荧光 磷光 与入射光波长的关系曲线 主要光谱参量 发射谱 固定激

6、发波长 一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位 扫描出 的化合物的发射光强 荧光 磷光 与入射光波长的关系曲线 吸收谱 化合物的吸收光强与入射光波长的关系曲线 15 主要光谱参量 吸收谱反映出的是物质的基态能级与激发态能级之间所有的允许跃迁 通常状态下的物质的表观颜色大部分时候取决于其吸收特性 激发谱则反映的是基态与所有与该荧光发射有关的能级之间的跃迁 其所 呈现的关系比吸收谱要有选择性 但有时候又不如吸收谱来的直接 电子跃迁到不同激发态能级时 吸收不同波长的能量 如能 级图 2 1 产生不同吸收 带 但均回到第一激发单重态 的最低振动能级再跃迁回到基 态 产生波长一定的荧光 如 2 因此 发射

7、谱的形状 与激发波长无关 16 斯托克位移 一个化合物的发射光谱常常与其吸收光谱很类似 但总是较相应 的吸收光谱红移 这称为斯托克位移 Stoke s shift 蒽在溶液中的吸收 虚线 和发射 实线 光谱 17 产生斯托克位移的主要原因 1 跃迁到激发态高振动能级的激发态分子 首先以更快的速 率发生振动弛豫 其速率在1013 s数量级 散失部分能量 达到零振动能级 一般从零振动能级发射荧光 2 激发态形成后 其分子的构型将很快进一步调整 以达到 激发态的稳定构型 这又损失了部分能量 3 发射荧光的激发态多为 态 这种激发态较基态时 有更大的极性 因此将在更大程度上为极性溶剂所稳定 使激 发态

8、的能量进一步降低 斯托克位移 18 不过 有时在高温下也可观察到反斯托克位移现象 即荧光光谱移向 吸收光谱的短波方向 这是由于高温使更多的激发态分子处于高振动 能级 荧光主要从激发态的高振动能级发出所致 既没发生斯托克位移也没发生反斯托克位移的荧光称共振荧光 反斯托克位移 19 荧光发射是光吸收的逆过程 荧光发射光谱与吸收光谱有类似镜影的 关系 但当激发态的构型与基态的构型相差很大时 荧光发射光谱将 明显不同于该化合物的吸收光谱 镜像规则 20 荧光光谱 固定激发光波长物质发射的荧光强度与发 射光波长关系曲线 如右图中曲线II 荧光本身则是由电子在两能级间不发生自 旋反转的辐射跃迁过程中所产生

9、的光 磷光光谱 固定激发光波长物质发射的磷光强度与发 射光波长关系曲线 如右图中曲线III 磷光本身则是由电子在两能级间发生自旋 反转的辐射跃迁过程中所产生的光 荧光光谱与磷光光谱 21 光谱图 22 自吸收现象 化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光 谱的长波长端重叠 产生自吸收 如蒽化合物 内滤光作用 溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧 光 如色胺酸中的重铬酸钾 内滤光作用和自吸收现象 200250300350400450500 荧光激发光谱荧光发射光谱 nm 蒽的激发光谱和荧光光谱 23 荧光寿命 荧光寿命 是荧光强度衰减为初始时的1 e所需要的时间 常用 表示 如荧光强度的衰减

10、符合指数衰减的规律 It I0e kt 其中I0是激发时最大荧光强度 It是时间t时的荧光强度 k是衰减常 数 假定在时间 时测得的It为I0的1 e 则 是我们定义的荧光寿命 24 寿命 是衰减常数k的倒数 事实上 在瞬间激发后的某个时间 荧光强度 达到最大值 然后荧光强度将按指数规律下降 从最大荧光强度值后任一 强度值下降到其1 e所需的时间都应等于 荧光寿命 25 如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量 则荧光 寿命与荧光发射速率的衰减常数成反比 荧光寿命 因此有 F 1 KF F表示荧光分子的固有荧光寿命 kF表示荧光发射速率的衰减常数 荧光发射速率即为单位时间中发射的光子数 26

11、处于激发态的分子 除了通过发射荧光回到基态以外 还会通过一 些其它过程 如淬灭和能量转移 回到基态 其结果是加快了激发态 分子回到基态的过程 或称失活过程 结果是荧光寿命降低 寿命 和这些过程的速率常数有关 总的失活过程的速率常数k可以 用各种失活过程的速率常数之和来表示 k kF ki ki表示各种非辐射过程的衰减速率常数 则总的寿命 为 1 k 1 kF ki 荧光寿命 27 由于吸收几率与发射几率有关 F与最大吸收位置的摩尔消光系数 max 单位为cm2mol 1或 mol dm 3 1cm 1 也密切相关 从下式可以得到 F的粗略估计值 单位为秒 1 F 104 max 注意 在讨论寿

12、命时 不要把寿命与跃迁时间混淆起来 跃迁时间是跃迁频 率的倒数 而寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间 通过测量寿命 可以得到有关分子结构和动力学方面的信息 荧光寿命 28 延迟荧光 一般荧光寿命为10 8s 最长可达10 6s 但有时却可能 观察到长达10 3s 这种长寿命的延时发射的荧光 被称 为延迟荧光或缓发荧光 延迟荧光与普通荧光的区别主要在于辐射寿命不同 这种长寿命的 延迟荧光来源于从第一激发三重态 T1 重新生成的S1态的辐射跃迁 即延迟荧光产生的过程为 S1 T1 S1 S0 h f 29 延迟荧光 E型延迟荧光 当第一激发单重态S1与第一激发三重态T1能差较小时 T1态有时可

13、从 环境获取一定的热能后又达到能量更高的S1态 即 T1 S1 这种现象首先从四溴荧光素 eosin 观察到 故得名E型延迟荧光 P型延迟荧光 当单重态 S1 与三重态 T1 能差较大时 T1不可能靠从环境取 得热能而到达S1态 这时有可能在两个三重态分子靠近时 通过两个 三重态分子的湮灭过程重新生成S1态 即 S1 S1 T1 T1 T1 T1 S0 S1 S0 S0 h p 这种现象首先从芘 pyrene 和菲 phenanthrence 观察到 故得名 P型延迟荧光 30 荧光量子产率是物质荧光特性中最基本的参数之一 它表示物质发射 荧光的效率 量子产率 荧光量子产率通常用 来表示 定义

14、为荧光发射量子数与被物质吸收 的光子数之比 也可表示为荧光发射强度与被吸收的光强之比 或表示 为荧光发射速率与吸收光速率常数之比 即 荧光发射量子数 吸收的光子数 kf S1 吸光速率 If Ia 31 量子产率 一般情况下 荧光量子产率 不随激发光波长而改变 这被称为 Kasha Vavilov规则 但如果形成的激发态会导致化学反应或系间窜越 与内转换的竞争 则可能使 受到影响 例如 在低压气相以254 nm 的光激发苯 0 4 而当以小于240 nm的光激发苯时 则未检测 到荧光 这是由于苯的高振动能级的S1态会使其转变为杜瓦苯 不同 化合物的 差别可以很大 另外 还会受环境 如温度 溶剂

15、等 的影响 例如 降低温度可 导致一个化合物的 增大 提高温度可导致一个化合物的 降低 32 量子产率 由于荧光的非单色性 各向的不均匀性和二级发射等原因 荧光量 子产率的直接测定的重复性往往较差 因此 实际测量中大多采用的 是相对法 即用一已知其荧光量子产率的参比化合物在相同条件下对 照测定 并可通过公式计算目标化合物的荧光量子产率 s I scs Is c s s cs和Is分别是参照物的荧光量子产率 已知 摩尔消光系数 溶 液浓度和荧光强度 c和I分别是被测物的荧光量子产率 未知 摩 尔消光系数 溶液浓度和荧光强度 参照物应是 已知 无自吸收 无浓度猝灭 在被测物所用溶剂中可溶 易 纯化

16、 稳定和对杂质不敏感的物质 常用的参照物如罗丹明B和喹啉硫酸氢盐 等 33 荧光产生的条件 化合物能够产生荧光的必要条件是 它吸收光子发生多重性不变的跃迁时所吸收的能量小 于断裂其最弱的化学键所需要的能量 另外 化合物要能发生荧光 其结构中必须有荧光基团 荧光基团都是含有不饱和键的基团 当这些基团是分子的 共轭体系的一部分时 则该化合物可能产生荧光 34 影响荧光的主要因素 1 荧光助色团与荧光消色团 可使化合物荧光增强的基团被称为荧光助色团 一般 为给电子取代基 如 NH2 OH等 相反 吸电子基团 如 COOH CN等将减弱或抑制荧光的产生 被称为荧 光消色团 35 影响荧光的主要因素 增加共平面的稠合环的数目 特别是当稠合环以线型排列时 将 有利于体系内 电子的流动 从而使体系发生跃迁所需吸收的能量 降低 进而有利于荧光的产生 2 增加稠合环可增强荧光 刚性增强后 将减弱分子的振动 从而使分子的激发能不易因振 动而以热能形式释放 另外 分子刚性的增加常有利于增加分子 的共平面 从而有利于增大分子内 电子的流动性 也就有利于荧 光的产生 3 提高分子的刚性可增强荧光 36 影响荧光