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1、第10卷第3期 高 校 化 学 工 程 学 报 No 3 Vol 10 1996 年 9 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Sept 1996 化学法和机械法从大肠杆菌释放 人肿瘤坏死因子 X 王光虎 冯小黎 修志龙 张志强 苏志国 大连理工大学化工学院生化工程研究所 大连 116012 摘 要 对化学法和机械法破碎基因工程大肠杆菌以释放人肿瘤坏死因子的影响因素作了考 察 在化学法破菌中研究了破碎时间 试剂浓度 溶液 pH 值 加入表面活性剂等因素的影响 在 机械法破碎中研究了停留时间 装珠量 搅拌转速 细胞浓度
2、等的影响 对操作条件进行了优化 通过对二者的比较 发现机械法破碎细胞效率高 但产生细小的碎片不利后分离 化学法释放产 物有选择性 但操作时间长 关键词 基因工程大肠杆菌 化学法破菌 机械法破菌 肿瘤坏死因子 1 前 言 随着基因工程技术的不断发展 越来越多的生物活性物质被成功地克隆表达在微生物 细胞内 使得某些具有重要医疗价值的蛋白质药物可以用微生物培养来生产 以大肠杆菌为 载体的表达产物大多分泌在细胞内 在分离提取它们时 必须先用化学或物理的方法将它们 从细胞内释放出来 由于细胞细小且具有较高的强度 破碎时必须使用剧烈的条件 但这又 易使活性产物失活变性 因此如何在打破细胞的同时保护产物的活
3、性是细胞破碎所关心的 问题 人肿瘤坏死因子 T umor Necrosis Factor 简称 TNF 是一种具有杀肿瘤细胞而不伤害 正常细胞活性的蛋白质 1 2 已被成功地表达在大肠杆菌内 文献上报道用溶酶法和超声波 法进行破碎 3 4 但这两种方法难以满足大规模操作的需要 5 6 Hettwer 和 Naglak 等 6 7 报道了用化学法从大肠杆菌中释放蛋白质 测量了两种微生 物酶的活性 从而提示化学法有可能成为大规模提取胞内蛋白质的一种方法 但是化学法能 否为生物技术工业接受 关键还是要看对大肠杆菌表达的人体蛋白质的提取 因此 本文以 药用蛋白质人 TNF 基因工程菌的破碎和活性测量为
4、例 对化学破菌法作了进一步的实验 研究 为了比较化学法与机械法的优缺点 本文又用水平式高速珠磨法破碎同一细胞 对两 种破菌过程中的主要影响因素进行了探索 在化学法中考察了破碎时间 试剂浓度 溶液pH 值 加入表面活性剂等因素对蛋白释放和 T NF 活性的影响 在珠磨法中考察了停留时间 装珠量 搅拌转速 细胞浓度等因素的影响 对操作条件进行了优化 并对二者作了对比 X1995 11 17收到初稿 1996 05 29收到修改稿 国家杰出青年科学基金和国家教委跨世纪人才计划基金资助项目 2 材料与方法 2 1 菌种 基因工程菌由中国预防医学科学院病毒学研究所基因工程国家重点实验室惠赠 宿主 菌为大
5、肠杆菌 JM103 质粒为pAT 153 表达的 TNF 不形成包涵体 2 2 主要设备与化学试剂 水平式高速珠磨机 Dyno Mill T yp KDL 型 为瑞士 Willy A Bachofen 公司产品 破 碎室容积0 15升 破菌剂为0 25 0 5 mm 的无铅玻璃珠 盐酸胍为进口分装分析纯 其它 试剂均为进口或国产分析纯 2 3 菌体的发酵培养 摇床种液以1 10的接种比接到五升含12 5 mg L 盐酸四环素的 LB 1 胰蛋白胨 0 5酵母粉 0 5 氯化钠 用氢氧化钠调节 pH 至7 50 培养基中 控制温度37 pH 7 50 通气量0 5 0 6 vvm 搅拌桨转速20
6、0 260 rpm 发酵至对数生长期末期 约12小时 收获 2 4 破碎方法 2 4 1 化学法 离心收集菌体 用蒸馏水冲洗2 3次 以液质比1 3把菌体悬浮在一定浓度的盐酸胍溶 液中 0 低速搅拌 一定时间后取破碎液于4 12000 rpm 离心20分钟 取上清液分析蛋白 质浓度和T NF 活性 2 4 2 珠磨法 蒸馏水冲洗过的菌体由0 02M 的 PBS 再悬浮 在4 冰箱中冷却8 10分钟后把玻璃珠 和细胞悬浮液以一定的液珠比加入 Dyno Mill 的破碎室中 调整搅拌桨转速 开机破碎 保 持一定停留时间后取样检测 T NF 活性和蛋白质浓度 2 5 T NF 活性分析方法 参照Ag
7、garwal 8 的方法 L929细胞由中国预防医学科学院病毒学研究所基因工程国家 重点实验室提供 该细胞用含10 小牛血清的 RPMI1640培养 选择生长旺盛的 L929细胞 加入96孔板中 每孔1 3 10 4个细胞为宜 置37 5 CO 2培养箱中培养24小时 达到50 70 成片为宜 把原培养基倒掉 加入0 1 ml 含10 小牛血清及1微克 毫升放线菌素 D 的 RPMI1640培养液 再加入不同稀释度的样品液 置37 5 CO2培养箱中继续培养24小时 观察细胞存活情况 以杀死50 L929细胞的稀释度为一个活性单位 2 6 蛋白质浓度测定方法 用 Brandford 法 9 以
8、牛血清蛋白为基准 3 结果与讨论 3 1 大肠杆菌的细胞壁结构及破碎方案选择 大肠杆菌是革兰氏阴性菌 其细胞壁和细胞膜共有三部分组成 最外层是外膜 其中大 298 高 校 化 学 工 程 学 报 部分是脂多糖 中间是肽聚糖 内部是内膜 其中肽聚糖是由聚糖链借肽键交连而成 具有较 高的强度 是细胞壁的骨架 大肠杆菌的肽聚糖层比较薄 约为1 5 2 0 nm 盐酸胍能溶解细胞壁和细胞膜上的蛋白质 溶解外膜上的脂多糖 改变肽聚糖层的网状 结构 从而破坏细胞壁和细胞膜 释出胞内蛋白 而珠磨法则是依靠高速搅拌带动玻璃珠和 细胞进行相对运动 产生极强的剪切力 打破细胞壁和细胞膜 释出内含物 3 2 化学法
9、破碎 3 2 1 操作时间对蛋白质释放和T NF 活性的影响 图1是加入7M 盐酸胍后细胞悬浮液中蛋白质浓度和 T NF 活性随时间的变化 图中两 条曲线都是先上升后下降 各有一个最大值范围 其中蛋白质浓度在8小时左右 TNF 活性 在4小时左右 由此可见 操作时间对于化学法破细胞有重要的影响 一般说来 时间越长 被 破开的细胞数量越多 释放出来的蛋白质就会越多 液相中的蛋白质浓度会逐渐趋向一个最 图1 化学破菌中时间对蛋白质释放 和T NF 活性的影响 Fig 1 Effect of disruption time on T NF activity and protein release b
10、y using 7M Guan HCl 温度0 液质比1 3 pH8 0 浓度7M 图2 化学破菌中盐酸胍浓度对蛋白质释放 和 T NF 活性的影响 Fig 2 Effect of Guan HCl concentration on protein and T NF activity 温度0 液质比1 3 pH8 0 时间4小时 图3 化学破菌中pH 值对蛋白质释放 和 T NF 活性的影响 Fig 3 Effect of pH on protein release and TNF activity 温度0 液质比1 3 时间4小时 浓度7M 1 5 8 2 7 2 3 8 0 4 9 0 大
11、值 但是 和其它细胞破碎方法一样 化学法破菌 也会使蛋白质空间结构破坏 甚至发生水解 造成产 物的活性下降 在本工作中 T NF 活性的指标更重 要 因此选择破碎时间为4小时是合适的 3 2 2 盐酸胍浓度对蛋白释放和T NF 活性的影响 结果如图2所示 由图2可以看出 随着盐酸胍浓 度的提高 蛋白质浓度和 TNF 的活性都增大 这个 结果是预料之中的 因为试剂浓度增大 细胞周围有 更多的盐酸胍分子 加快了破细胞的速度 使得更多 的蛋白质溶解出来 因此在用盐酸胍破菌时 可以使 用较高的浓度 以提高破菌的程度 3 2 3 试剂 pH 值的影响 图3是不同 pH 值对蛋白质释放量和 T NF 活性
12、 299 化学法和机械法从大肠杆菌释放人肿瘤坏死因子 的影响 随着悬浮液由弱酸性变到弱碱性 破碎液中蛋白质含量和 TNF 活性先上升而后缓 慢下降 在 pH 为8 0左右达到最大值 这可能是因为碱性溶液对细胞壁和细胞膜系统的碱 溶性蛋白有水解作用 使其易于破碎 另外碱性溶液对蛋白质有促溶作用 使破开后的细胞 的胞内蛋白迅速释放出来 但是 pH 值太高 将会使盐酸胍 NH2 2CH NH HCl 分解 从 而影响化学法破细胞 图4 珠磨法破碎时时间对蛋白质释放 和 TNF 活性的影响 Fig 4 Effect of disruption time on protein release and T
13、NF activity 0 25 0 5 mm 玻璃珠 搅拌转速2500 rpm 液珠比1 1 细胞浓度10 pH 7 0 3 2 4 其它因素的影响 在化学破菌过程中 温度也是一个影响因素 一般认 为 高温易引起蛋白质失活变性 所以生化分离过程大都 采用低温操作 化学法破菌操作时间比较长 为了尽量减 小过程中活性蛋白质的损失 本文亦选择0 低温操作 本文考察了加入 Triton X 100对破碎的影响 结果 发现T riton X 100的加入能增大蛋白释放量 但 T NF 的 活性却大大降低 由于篇幅所限 结果未附 3 3 珠磨法破碎 3 3 1 破碎停留时间的影响 如图4所示 随着破碎时
14、间的增加 蛋白浓度 TNF 活性都有一个缓慢上升和趋于下降的过程 可见破碎停 留时间太短 细胞破碎率低 蛋白释放不完全 时间太长 强力剪切易造成蛋白变性 且产生的细胞碎片更加细小 不利于后分离 本文破碎时间选择在1 5 3分钟能达到 较好的破碎效果和较高的 TNF 活性 3 3 2 装珠量的影响 如图5 图6 由图可以看出 装珠量加大 液珠比减小 蛋白释放和 T NF 活性提高 这 是由于装珠量的增加使珠子与珠子 珠子与细胞 细胞与细胞之间的剪切作用和磨擦作用增 强 使更多的细胞破碎 但是 过高的装珠量也会导致过强的剪切力 造成蛋白质失活 另一 图5 装珠量对蛋白质释放和T NF 活性的影响
15、Fig 5 Effect of bead load on protein release and T NF activity 图6 装珠量对T NF 比活性的影响 Fig 5 Effect of bead load on T NF specific activity 时间1 5分钟 0 25 mm 玻璃珠 搅拌转速2500 rpm 细胞浓度10 pH 7 0 1 1 16 2 1 04 3 0 92 4 0 82 300 高 校 化 学 工 程 学 报 方面 装珠量增加也必然减少细胞处理量 因此 液珠比选择在0 9 1 0为宜 3 3 3 搅拌转速的影响 搅拌桨转速提高 电机输入功率增大 将使
16、更多的细胞破碎 释放出胞内蛋白 同时 输 入功率增大 必然产生大量的热量 使温度升高 如图7所示 而搅拌桨转速的提高 产生了很大的剪切力 这可能破坏某些蛋白质的活性结构 另外 温度升高也使蛋白质变性 导致 T NF 活性和比活性降低 图8中 搅拌桨转速选在2500 rpm 或3200 rpm T NF 活性和比活性都比较高 图7 搅拌转速对蛋白质释放和温度的影响 Fig 7 Effect of agitation speed on protein release and temperature increase 图8 搅拌转速对T NF 活性和 TNF 比活性的影响 Fig 8 Effect of agitation speed on T NF activity and specific activity 时间1 5分钟 液珠比1 1 细胞浓度10 pH 7 0 3 3 4 细胞浓度的影响 蛋白释放量与细胞浓度很有关系 细胞浓度大 破碎的细胞多 蛋白质释放浓度就高 但 细胞浓度过高 引起粘度升高 使温升增大 10 在本文探索的细胞浓度范围内 蛋白释放量 随细胞浓度的提高而增大 T NF
