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1、LOGO 蛋白质的SDS PAGE电泳 一 实验目的 学习SDS PAGE测定蛋白质分子量的原理 掌握垂直板电泳的操作方法 二 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺 Acr 和交联剂N N 甲叉双丙烯酰胺 Bis 在 加速剂N N N N 四甲基乙二胺 TEMED 和催化剂过硫酸铵 AP 或核黄素的作用下聚 合交联成三维网状结构的凝胶 以此凝胶为 支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 分子量范围与凝胶浓度的关系 丙烯酰胺浓度 线性分离范围 kD 1512 43 1016 68 7 536 94 5 057 212 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶
2、电泳时 它的迁移率取 决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素 如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂 十二烷基磺酸钠 SDS 则蛋白质分子的电泳迁移 率主要取决于它的分子量 而与所带电荷和形状 无关 因此可以利用SDS PAGE测定蛋白质分子量 当蛋白质的分子量在15KD 200KD之间时 电 泳迁移率与分子量的对数呈线性关系 凝胶由分离胶和浓缩胶组成 上层为浓缩胶 凝胶孔径较大 没有 分子筛效应 其pH为6 8 由于快慢离子所 形成的高电压梯度 使得变性蛋白质分子在 泳动中被压缩为很薄的一层 大大提高了分 辨率 下层为分离胶 凝胶孔径较小 有分 子筛效应 pH为8 8 变性蛋白质分子所
3、带 负电荷基本一致 泳动速度主要决定于分子 量 电泳过程中分子迁移的规律 小分子走在前头 大分子滞后 混合样品 带孔胶 按分子 大小分离 电泳方向 电泳 小分子 大分子 三 实验试剂和器材 1 材料 标准蛋白 2 试剂 1 30 丙烯酰胺 2 10 SDS 3 分离胶缓冲液 1 5mol L Tris HCl pH 8 8 4 浓缩胶缓冲液 0 5mol L Tris HCl pH6 8 试剂 5 10 过硫酸铵 APS 溶液 6 四甲基乙二胺 TEMED 7 SDS上样缓冲液 Tris HCl SDS 溴酚蓝 甘 油 2 巯基乙醇 8 电极缓冲液 Tris 甘氨酸缓冲液 9 染色液 甲醇 水
4、 冰乙酸 考马斯亮蓝R250 10 脱色液 甲醇 水 冰乙酸 3 实验器材 垂直板电泳装置 稳压稳流电泳仪 脱色摇床 移液枪 滤纸 大培养皿 各部分凝胶配制 分离胶 10 10ml 浓缩胶 5 10ml ddH2O4 05ml6 8ml 30 Acr3 3ml1 7ml Buffer 1 5mol L pH 8 8 Tris HCl 2 5ml 0 5mol L pH 6 8 Tris HCl 1 25ml 10 SDS100 l100 l 10 Ap50 l100 l TEMED10 l10 l 四 实验步骤 1 安装制胶模具 2 调制分离胶 10 加入10 APS和 TEMED 混匀 立即
5、灌注至模具高度的70 3 加一层纯水 约30min后聚合 4 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干 5 调制浓缩胶 5 加入10 APS和 TEMED混匀 立即灌注插入梳子 静置 40min 加入分离胶溶加入分离胶溶 液液 pH 8 8pH 8 8 封水或饱和封水或饱和 正丁醇溶液正丁醇溶液 出现明显界面时 分离胶凝聚完成 min h 倒出水或正丁醇 并用滤纸吸干 v制备分离胶 封水的目的是使分离胶上表面平直 并排除气泡 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面 分离胶分离胶 pH 8 8pH 8 8 加入浓缩胶溶 液 pH6 8 v制备浓缩胶 样梳需一次平稳插入 梳 口处不得有气泡 梳底需 水
6、平 插入样品梳 6 样品及标准品的准备 标准品按说明书进 行处理 样品加入ddH2O溶解后 再加入 SDS上样缓冲液 7 加样电泳 每孔加样15 l 开始8V cm 60V 染料进入分离胶时 电压提到 15V cm 110V 继续电泳 让溴酚蓝到 达分离胶底部时关闭电源 8 卸下玻板 剥离凝胶放在器皿内 切去一 角作为方位标记 加入电极缓冲加入电极缓冲 液液pH 8 3pH 8 3 浓缩胶浓缩胶 pH pH 6 86 8 通电通电 分离胶分离胶 pH 8 8pH 8 8 加入样品加入样品 v上样及电泳 开始电流恒定在开始电流恒定在10mA10mA 当进入分离胶后改为 当进入分离胶后改为20mA
7、20mA 溴酚蓝距凝胶边缘约溴酚蓝距凝胶边缘约5mm5mm时 停止电泳 时 停止电泳 9 染色 用至少五倍体积染色液浸泡凝胶 于平缓摇摆平台上室温1h左右 10 脱色 用蒸馏水漂洗数次 再用脱色液 脱色 至蛋白质条带清晰 注意事项 1 安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定 螺丝 防止夹坏玻璃板 避免缓冲液渗漏 2 凝胶配制过程要迅速 催化剂TEMED要在 注胶前再加入 否则凝结无法注胶 注胶过 程最好一次性完成 避免产生气泡 3 梳子需一次平稳插入 梳口处不得有气泡 梳底需水平 4 微量注射器 加样器 上样时 注射器 不可过低 以防刺破胶体 也不可过高 样 品下沉时易发生扩散 溢出加样孔 5 剥
8、胶时要小心 保持胶完好无损 染色要 充分 6 聚丙烯酰胺具有神经毒性 操作时要戴 手套 思考题 1 SDS在该电泳方法中的作用是什么 2 在SDS PAGE中TEMED和AP的作用 浓缩胶的作用是有堆积作用 凝胶浓度较小 孔 径较大 把较稀的样品加在浓缩胶上 经过大孔 径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带 当样品液和浓缩胶选Tris HCL缓冲液 电级液选 Tris 甘氨酸 电泳开始后 HCL解离成氯离子 甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子 蛋白质带负 电荷 因此一起向正极移动 其中氯离子最快 甘氨酸根离子最慢 蛋白居中 电泳开始时氯离 子泳动率最大 超过蛋白 因此在后面形成低电 导区 而电场强度与低电导区成反比 因而产生 较高的电场强度 使蛋白和甘氨酸根离子迅速移 动 形成以稳定的界面 使蛋白聚集在移动界面 附近 浓缩成一中间层
