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1、2015版药典无菌检查法与微生物鉴定方法 药品检验与研究所抗生素室 无菌是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物 无菌检查法用于检查药典要求无菌的药品 生物制品 医疗器具 原料 辅料及其他品种是否无菌的一种方法 无菌操作是指在无菌环境条件下 在对无菌制品或无菌器械等进行检验的过程中 能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法 无菌技术是指在微生物试验工作中 控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施 其中包括无菌环境设施 无菌试验器材及无菌操作 无菌检查法的局限性由于无菌是一个相对的概念 因此 对无菌检查的结果应该有一个正确的认识 即产品通过无菌检查仅仅意味着在该检验条件下 供
2、试品未发现有微生物污染 并不表示所有的产品都是无菌的 反之 当供试品中检出微生物污染 则可以认为批产品的微生物污染风险相当高 从理论上来说 要确定某批产品的无菌性 应对每个容器进行无菌检查 但是无菌试验对样品是破坏性的 因此不可能对每一最小包装的产品进行检查 统计概率的局限性 对于低污染水平的产品 其局限性在统计学上更为明显 检验条件的局限 样品中污染的微生物的检出受多种因数的影响 只有在各检验条件符合污染微生物的修复和生长时 才能保证被检样品的无菌检验结果的准确性 污染的检出率要比实际产品的污染率低 无菌检查存在检查失误的可能性 这可能是因为污染菌浓度太低 或是污染菌生长太慢 或是因为培养基
3、不良等原因 在培养期间污染菌根本就不生长 产品的染菌率愈小 错判合格的可能性就愈大 所以在评价某个无菌制品的某个批的无菌状态时 仅依靠最终产品的无菌检查是不充分的 局限性较大 对无菌制品来说 生产最终产品的所有系统的工艺才是最重要的 2015版中国药典无菌检查法 2015版中国药典无菌检查法的修订无菌检查法的方法适用性试验无菌检查法的注意事项 2015版中国药典无菌检查法的修订 实验环境的修订检查用培养基的修订具体修订内容 实验环境的修订 修订的依据 修订依据及意义 2010版GMP附录一 无菌药品 和附录三 生物制品 中均规定 非最终灭菌产品各工序关键操作环境应为B级背景下的A级 无菌检查的
4、洁净环境不得低于生产关键区的洁净环境要求 ICH 检查方法中要求 试验应在无菌条件下进行 防止微生物污染的措施不得影响供试品中微生物的检出 2015版中国药典通则 9203药品微生物实验室质量管理指导原则9205药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则9206无菌检查用隔离系统验证指导原则 GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准 无菌隔离系统的使用及验证 9206无菌检查用隔离系统验证指导原则1 操作验证2 完整性验证3 灭菌验证4 灭菌循环验证5 内部洁净度验证6 仪器仪表验证 培养基的修订 我国药典无菌检查法与欧美药典的差异2015版药典的修订 培养基的主要修订 硫乙醇酸盐流体培养基 F
5、luidThioglycollateMedium 大豆胰酪胨培养基 TSB 改良马丁培养基 菌液制备用培养基的修订 培养基灵敏度检查 无菌检查方法的整合 以2010年版药典二部为基础 整合保留了生物制品无菌检查法的特点 在检验数量 检验量 阳性对照 培养温度方面互相兼顾 生物制品的无菌检查中硫乙醇酸盐流体培养基为双份 分别置30 35 20 25 两个温度培养 USP EP BP JP ICH无菌检查法中对生物制品均没有作出特殊规定 无菌检查方法的主要修订 方法验证试验 修订为 方法适用性试验 若该产品的组分或原检验条件发生改变时 检验方法应重新验证 修订为 若检验程序或产品发生变化可能影响检
6、验结果时 应重新进行方法适用性试验 方法适用性试验 培养时间由 3 5天 修订为不得超过5天 方法适用性试验的修订 检验数量 是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量 成品每亚批均应进行无菌检查 2015版药典四部通则1101表2 上市抽验样品的最少检验数量 除抗生素和血液制品外 V 100ml液体制剂的最少检验数量由2010年版药典6瓶 支修订为10瓶 支 即所有上市抽验样品除抗生素和血液制品外的最少检验数量为10瓶 支 增加了供试品检验数量 方法适用性试验用菌株 无菌检查法的方法适用性试验 菌液制备要点 新鲜培养物 混匀 每一稀释剂更换吸管 生孢梭菌可以用硫乙醇酸盐流体培养基计数 一般16
7、 18h内观察 菌液制备要点 采用琼脂斜面上的培养物制备菌液时 尽量使菌苔分散 黑曲霉可制成稳定的孢子悬液保存在2 8 对于同一份试验菌培养物 采用相同的稀释步骤 不同的实验人员对菌数的测定结果可能存在较大的差异 G 芽孢杆菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌需氧层厌氧层均生长 枯草芽孢杆菌仅在需氧层生长 生孢梭菌仅在厌氧层生长 取样量的确定 例 批生产量 500个的规格为1ml的注射液 表1规定接种每种培养基的最少检验数量为20个或2 取较少者 表3规定全量接种 直接接种法每管培养基接种样品的量 6验证 一次 薄膜过滤法每株菌20瓶 6株菌120瓶直接接种法40瓶 阳性无菌检查薄膜过
8、滤法40瓶 20瓶 阳性 60瓶 方法适用性试验结果的判断 与对照管比较 如含供试品的各试验管的实验菌均生长良好 可照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查 如含供试品的任一试验管的实验菌生长微弱 缓慢或不生长 可采用增加冲洗量 增加培养基用量 使用中和剂 更换滤器品种等方法 重新进行方法验证 无菌检查法的注意事项 培养基的要求 灵敏度检查符合规定 硫乙醇酸盐流体培养基氧化层 接种前 培养基氧化层的高度不超过培养基深度的1 5 否则须经100 水浴加热至粉红色消失 不超过20分钟 迅速冷却 只限加热一次 并防止过程中污染 培养后 装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层不超过培养基的1
9、 2 检验方法的选择 薄膜过滤法 一般采用封闭式滤器 只要供试品性质允许 应采用薄膜过滤法 直接接种法 适用于无法用薄膜过滤法进行实验的品种 供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同 无菌试验过程中 若需使用表面活性剂 灭活剂 中和剂等试剂 应证明其有效性 且对微生物无毒性 常用中和剂比例 0 1 大豆卵磷脂0 1 1 吐温80卵磷脂 吐温80及L 组胺酸用于中和醛类及酚类化合物卵磷脂及吐温80中和季铵盐卵磷脂中和氯己定吐温80中和双三氯酚及汞化合物 薄膜过滤法 水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜 油类供试品 其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥 为
10、发挥滤膜的最大过滤效率 应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面 供试液经薄膜过滤后 若需要用冲洗液冲洗滤膜 每张滤膜每次冲洗量一般为100ml 且总冲洗量不得超过1000ml 以避免滤膜上的微生物受损伤 直接接种法 除另有规定外 每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10 同时 硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml 胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml 供试品检查时 培养基的用量和高度同方法适用性试验 接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份 一份置30 35 培养 一份置20 25 培养 供试品的无菌检查 阳性对照应根据供试品特性
11、选择阳性对照菌 无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品 以金黄色葡萄球菌为对照菌 抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌 抗厌氧菌的供试品 以生孢梭菌为对照菌 抗真菌的供试品 以白色念珠菌为对照菌 阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验 加菌量小于100CFU 供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量 阳性对照管培养72小时应生长良好 供试品的无菌检查 阴性对照供试品无菌检查时 应取相应溶剂和稀释液 冲洗液同法操作 作为阴性对照 阴性对照不得有菌生长 培养和观察 硫乙醇酸盐流体培养基置30 35 胰酪大豆胨液体培养基置20 25 培养14天 逐日观察记录 阳性对照管应生长良好 阴
12、性对照管不得有菌生长 无菌检查一次检出 培养基浑浊 培养14天后不能判断 转种至同种新鲜培养基中 培养三天 或取培养液涂片 染色镜检 结果判断 阳性 阴性 供试品管浑浊 即判不合格除非能充分证明试验结果无效 即生长的微生物非供试品所含的微生物 设备 环境的微生物监控结果超标 回顾实验过程 发现污染因素 鉴定微生物 确认是操作引入的 无菌试验经确认无效 可重试 实验过程监控 表面监控环境菌监控手部监控 环境微生物归属 约大于50 的革兰氏阳性菌来自人员 30 的革兰氏阳性芽孢杆菌来自产品外包装 酒精对革兰氏阳性芽孢杆菌无效 革兰氏阴性假单胞菌存在于新洁尔灭中 丁基胶塞会因负压而将消毒剂中的污染菌
13、引入样品 无菌程序保障 无菌检查样品前处理 分批消毒 实验 混合 统一消毒 统一实验严格遵守外表面消毒程序 一般环境酚类 洁净环境过氧乙酸 75 乙醇 无菌级 增加过程监控力度 表面菌采样 手部采样 每批 动态浮游菌采样 下风口 微生物鉴定 微生物鉴定指导原则 通则9204 为非无菌药品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定 以及药物原料 辅料 制药用水 中间体 终产品和环境中检出微生物的鉴定提供指导 当微生物的鉴定结果有争议时 以 伯杰氏系统细菌学手册 Bergey sManualofSystematicBacteriology 现行版的鉴定结果为准 微生物鉴定 微生物鉴定是指借助现有的分类系统
14、 通过对未知微生物的特征测定 对其进行细菌 酵母菌和霉菌大类的区分 或属 种及菌株水平确定的过程 它是药品微生物检验中的重要环节 药典通则相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确规定 如 非无菌产品的微生物检查 控制菌检査 通则1106 中选择培养基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定 对 无菌检查法 通则1101 的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定 以判定试验是否重试 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 通则9205 中建议对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定 以掌握环境微生物污染情况 有助于污染调查 微生物分类 界 Kingdom Regnum 门 Phylum Phylum
15、纲 Class Classis 目 Order Ordo 科 Family Familia 属 Genus Genus 种 Species Species 微生物分类 每一分类单位之后可有亚门 亚纲 亚目 亚科 词尾 门 phyta 纲 mycetes 目 ales 科 aceae 亚目 ineae 亚科 oideae 种 是最基本的分类单位 一大群表型特征高度相似 亲缘关系极其接近 与同属内其他种有明显差别的菌株的总称 客观存在 相对稳定 来自共同祖先 有着相近的亲缘关系 形态 生理特征上表现十分相似 存在差异和变异 变异发展到一定程度 即形成新种或变种 变种 种内某一个体可能由于突变而发生
16、变异 在自然选择和人工选择下 这种变异会在种内不断扩散 最后形成某些遗传性不同于原种的一个群体 亚种 指某一明显而稳定的特征与模式种不同的种 有时称小种 在微生物学中 通常把实验室所获得的变异菌株称之为亚种 型 同种微生物彼此之间的区别不如变种显著 一般表现在菌体的化学组分上 如 结核杆菌人型 牛型和禽型 菌株 strain 又称品系 指一种微生物的不同来源的纯培养物 在微生物学的研究中运用最为广泛 从自然界中分离到的每一个纯培养物都可以称为一个菌株或品系 自然界 种 有限 菌株 无限 微生物鉴定需达到的水平视情况而定 包括种 属鉴定和菌株分型 大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中 对所检出微生物的常规特征包括菌落形态学 细胞形态学 杆状 球状 细胞群 孢子形成模式等 革兰染色或其他染色法 及某些能够给出鉴定结论的关键生化反应 如氧化酶 过氧化氢酶和凝固酶反应 进行分析 一般即可满足需要 非无菌产品的控制菌检査一般应达到种属的水平 无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺 如培养基灌装 失败时 对检出的微生物鉴定至少达到种属水平 必要时需达到菌株水平 菌株保藏中心 美国典型
