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1、PCR检测技术的临床应用 刘学强189941819172017年3月 学习内容 PCR快速检测技术综述前言临床意义PCR检测的开展条件PCR检测技术的基本原理反应特点PCR体系反应步骤PCR检测临床案例 各步骤注意事项 样品处理提取核酸PCR扩增产物凝胶电泳 PCR快速检测技术综述 聚合酶链式反应 PolymeraseChainReaction PCR 是1985年由美国科学家发明的 聚合酶链式反应 PCR 是体外选择性扩增基因片段的技术 具有特异 敏感 快速 简便 重复性好 易自动化等突出优点 能在一个试管内将所要检测的目的基因片段短时间内扩增至数百万倍 肉眼能直接观察和判断 前言 PCR快
2、速检测技术综述 PCR是分子生物学实验室的常规方法 可用于 疾病快速检测基因组测序制备单链模板目的基因的获得基因组克隆基因突变基因功能和表达调控的研究 临床意义 动物的致病微生物如细菌 病毒 衣原体 支原体等均可通过PCR检测到 早期诊断 因为PCR扩增极其敏感 致病微生物感染潜伏期即可被PCR法检出 对低持续感染病毒的诊断 有些体内的病毒长期低复制感染 血清病毒浓度极低 一般酶标试剂无法检出 可以用PCR法检出 疗效跟踪及病程判断 因为PCR能定量检测病毒基因 是病毒数量多少的最直接指标 PCR快速检测技术综述 动物疾病检测 设备试剂昂贵专业人员的配备程序优化PCR实验的环节很多 而且对每一
3、环节的质量要求都很高 PCR检测的开展条件 PCR快速检测技术综述 PCR定义PCR polymerasechainreaction 即聚合酶链式反应技术 是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用 通过变性 退火 延伸的循环操作 在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术 为什么扩增 PCR的基本原理 PCR的基本原理 PCR的分子基础 核酸除阮病毒 羊瘙痒病 疯牛病 外所有生命体的遗传物质 是PCR扩增的模板 PCR的基本原理 PCR的基本原理 PCR的反应特点特异性强 PCR以特定靶序列为检测目标 针对性强 所以具体很强的特异性 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的 理论上可以检
4、出一个病原体单拷贝基因的存在 简便 快速 PCR反应一般在2 4小时完成扩增反应 对标本的纯度要求低 几乎所有的临床样品都可以作为PCR的检测材料 对病原微生物只要求样品中有完整的靶序列核酸 不一定有存活的病原体 PCR的基本原理 PCR反应体系及作用模板DNA或RNA特异性引物 耐热DNA聚合酶dNTPsMg2 PCR缓冲液 模板为混合物 引物决定特异性 模板DNA PCR的基本原理 PCR反应步骤 由PCR仪完成 变性 目的双链DNA片段在94 下解链退火 两种寡核苷酸引物在适当温度 50 左右 下与模板上的目的序列配对延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下 以dNTP为
5、反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链 PCR的基本原理 PCR的基本原理 DNA双螺旋结构及合成 单个循环扩增 PCR的扩增 变性94 延伸72 退火Tm 5 PCR的基本原理 25 35个循环放大几百万倍 变性94 5min变性94 30s退火45 65 30s25 35个循环延伸72 30s 8min最后一次延伸72 10min反应终止后 将样品保存于4 或进行凝胶电泳 以鉴定是否得到特异的扩增产物 PCR的基本原理 小结 人为模拟体内的病毒核酸复制 应用一系列检测仪器及试剂把微观的体内病毒核酸放大成宏观的可观测结果 来自病料的极
6、微量核酸不可观测 数百万倍模板核酸拷贝可观测 PCR PCR的基本原理 PCR操作流程 PCR检测临床案例 PCR检测临床案例 样品处理 注意取病变明显部位1 3组织 2 3生理盐水避免样本间污染单样本内可混合不同组织冷冻保存样品至少一周 PCR检测临床案例 PCR检测临床案例 提取核酸 目的 获得目的基因模板离心柱型核酸提取试剂盒采用改进的SDS 碱裂解法裂解组织匀浆 离心吸附柱内的硅基质膜选择性地结合溶液中的核酸 再通过漂洗液将杂质和其它成分去除 最后用洗脱缓冲液将纯净核酸从硅基质膜上洗脱 PCR检测临床案例 裂解液 洗液 洗脱液 离心吸附柱 PCR检测临床案例 核酸提取流程 提取病料核酸
7、 模板 洗脱核酸 PCR检测临床案例 注意上清液杂质 堵避免各步操作样本间污染RNA降解洗脱液点在硅基质膜中央个人防护 PCR检测临床案例 PCR检测临床案例 核酸 模板DNA或RNA 小结 PCR检测临床案例 PCR扩增 目的 将微量模板扩增至数百万倍PCR反应的模板可以是cDNA 基因组DNA或RNA 当用RNA作为模板时 首先要进行反转录生成cDNA 然后再进行正常的PCR扩增 RNADNA 37 1h 反转录体系 反转录 RNA病毒扩增前需要反转录成cDNA 如PRRSV CSFV PCR检测临床案例 PCR检测临床案例 PCR体系 模板DNA PCR检测临床案例 取扩增体系 体系瞬离
8、 向扩增体系中加入模板 设置程序 开始扩增 PCR检测临床案例 扩增产物暂存4 等待电泳 扩增产物 PCR检测临床案例 注意防止交叉污染阳性对照非特异性扩增反复冻融 分装PCR专用物品个人防护 PCR检测临床案例 PCR检测临床案例 PCR产物电泳 目的 检测PCR产物中是否存在预期的基因片段DNA分子在电泳缓冲液中带负电荷 在电场中向正极移动 而琼脂糖凝胶具有分子筛作用 不同大小的核酸 其移动速度有差异 因此 利用这种双重效应达到分离核酸的目的 PCR检测临床案例 琼脂糖凝胶电泳所需器材 GoldViewMarkerLoadingBuffer 梳子 TAE 琼脂糖 核酸染料可嵌入核酸双链的碱
9、基对之间 在紫外线激发下发出荧光 所以 电泳后凝胶在紫外灯下可直接观察分离到的目的基因片段条带 PCR检测临床案例 PCR检测临床案例 电泳仪电泳槽 胶槽电泳槽 胶板凝胶成像系统 TAE电泳缓冲液 胶液 琼脂糖 核酸染料 1 2 0 01 200ml PCR检测临床案例 配制琼脂糖胶液 微波炉 3min 琼脂糖凝胶分离DNA的范围 PCR检测临床案例 PCR检测临床案例 配制琼脂凝胶 溶胶 梳子 凝胶装置 胶槽 胶板 PCR检测临床案例 组装凝胶装置并调平 PCR检测临床案例 PCR检测临床案例 倒胶凝胶 倒胶 一次倒成 凝胶 室温静置至少30min PCR检测临床案例 小心拔去梳子 取出胶槽
10、 电泳缓冲液没过胶面 PCR检测临床案例 电泳槽接通电泳仪 电极 PCR检测临床案例 扩增产物上样前处理 处理后产物 LoadingBuffer PCR扩增产物 点样 样品 marker PCR检测临床案例 点样跑胶 点样完毕 开始电泳 电泳结束 PCR检测临床案例 凝胶成像 图像采集 PCR检测临床案例 检测结果 PCR检测临床案例 2号 7号PRRS阳性 400bp 8号CSF阳性 170bp 使用完生物安全柜后进行紫外线消毒 填写实验记录 PCR检测临床案例 注意夏季凝胶时间长慢拔梳子点样避免PCR产物漂移点样时避免刺破胶孔避免跑过用电泳缓冲液制备琼脂糖凝胶核酸染料为致癌物质 防护 PCR检测临床案例 小结 配胶溶胶装胶板倒胶凝胶拔梳子移胶加电泳液连电泳仪产物加上样液点样跑胶凝胶成像图像采集 PCR检测临床案例
