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1、. . .5-azaC处理水稻幼苗对基因组DNA 甲基化及水稻生长发育的影响表观遗传学：不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。表观遗传变异包括: X染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如DNA 甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。DNA 甲基化：在DNA 复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM) 上的甲基基团连接到DNA 分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。DNA 甲基化的方式胞嘧啶甲基化腺嘌呤甲基化DAM (DNA 腺嘌
2、呤甲基转移酶)识别回文序列GATC, 在此位置两条链的腺嘌呤N-6位置上同时甲基化，同时SAM 转变为SAH(S-腺苷高半胱氨酸)在DMT(DNA甲基转移酶）的作用下，CpG（CNG,CCGG）位点胞嘧啶C5被甲基化DNA 甲基化作用DNA甲基化的生物学意义影响基因表达状态 ： 通过该表基因调控区DNA 甲基化程度调控基因转录参与基因组防御 ：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子）处于沉默状态提高环境适应能力 ：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型DNA 胞嘧啶甲基化的种类和形成从化头甲基化 (de novo methylation)DNMT3a ，DNMT3b在 完全没有 甲基化的DN
3、A 上 加 上 甲基 。维持化 甲基化 (maintenance methylation)Met1 ，DNMT1较特异地识别半甲基化状态的DNA ，负责在细胞分裂过程中依据DNA 母链的甲基化状态给新合成的DNA 链上加上甲基。DNA 胞嘧啶甲基化检测方法使用对胞嘧啶5- 甲基化 状态 敏感 的 限 制 性 内 切酶 进行酶切处理， 然后检测多态性：甲基化敏感扩增多态性 (MSAP, Methylation SensitiveAmplification Polymorphism)胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序 ：重亚硫酸盐测序 (Bisulfite sequencing)GCmTACT重亚
4、硫酸钠GCmTATT测序此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG 岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等表1 甲基化 敏感 酶对不 同 甲基化 状态DNA 的切 割 结果CCm GG不切 割CCmGG不切 割 CC GG Msp I不切 割 CC GG Hpa IICmCGG CCGG 原 始 序列内 切酶? MSAP 流 程 ：提取基因组DNA（ 注意 发育 时 期和成 长 状态 相 同 ）ATCCGGTGGCTTGCCmGGACTAGGCCACCGAACGG CCTGMsp I 酶切+ 接头 Hap II 酶切+ 接头ATCC GGTGGCTTGCCm GGAC ATCC GGT
5、GGCTTGCCmGGACTAGG CCACCGAACGG CCTG TAGG CCACCGAACGG CCTGPCR PCRPAGE 电泳 PAGE 电泳Msp I5 CC(m)G G 33 GG C(m)C 5Hpa II5 CCGG 33 GGCC 3? 重亚 硫酸 盐 测 序实验目的使用不同浓度的5-azaC 溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组DNA 胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用MSAP 方法检测DNA 胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因DNA 甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型 。实验材料1、水稻：日本晴 (Oryza sativa var
6、japonica, nipponbare)2、所需仪器离心机、PCR仪、气浴摇床、水浴摇床、植物生长箱电泳仪 、电泳槽、微量移液器 、紫外分析仪、分析天平3、试剂（1）植物基因组DNA 改良CTAB 提取液：buffer A: 0.35mol/L Sorbitol ，0.1mol/L Tris-HCl pH7.5 ，0.5mmol/L EDTA;buffer B: 0.2mol/L Tris-HCl pH7.5 ，0.05mol/L EDTA ，2mol/L NaCl ，2%CTAB;buffer C: 5%N-lauroylsarcosine（2）PCR试剂：Takara rTaq ，10X
7、 PCR buffer ，ddH2O ，预扩增引物：H/M+0: (5-GACTGCGTACCAATTCA-3)PCR 引物 EcoRI+0: (5-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3)选择性扩增引物：H/M+AN: 5-GACTGCGTACCAATTCAA(T, C, G)-3EcoRI+AN: 5-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T, C, G)-3。（3）酶切-连接试剂：EcoRI (NEB) ，Hap II (NEB) ，Msp I (NEB) ，T4 DNA ligase ，T4 10 xreaction buffer（4） 接头：EcoRI adapter: 5-CT
8、CGTAGACTGCGTACC-3 CATCTGACGCATGGTTAAHapII/MspI adapter: 5-GATCATGAGTCCTGCT-3 AGTACTCAGGACGAGC（5）PAGE 试剂： 聚丙烯酰胺，尿素 ，AgNO 3 ，Na 2 CO 3 ，溴酚蓝 （6）银染固定/终止液 (10% 冰乙酸) ， 染色液 (2升双蒸水预冷，用时加2克硝酸银 ，3ml 37% 甲醛) ，显影液 (2升双蒸水中溶解60克碳酸钠 ，冷却至10-12C，用时 ， 加入3ml 37% 甲醛 ，400ul 硫代硫酸钠（10mg/ml）) 。（7）其它试剂：5-azaC(100mg/mL) ，蒸馏水
9、，PVP (20%) ， 氯仿: 异戊醇(24:1)，异丙醇 ，70% 乙醇 ，RNA 酶A (DNase-free) ，TE ，TAE ，琼脂糖 ，EB ， 未酶切的 DNA ，1xTBE (0.089M Tris-borate, 0.089 M Boric Acid, 0.002 M EDTA) ，3x loading buffer(300 mM NaOH, 97% formamide, 0.2% bromophenol blue)。实验方法1、水稻的培养（26 ， 暗培养）取水稻水稻种子20粒X 7组，将水稻种子用 75% 的酒精消毒后用无菌水浸泡数小时，当水稻种子露嘴时，分别置于90m
10、m 培养皿内的双层滤纸上，加15mL蒸馏水浸种24h（第一天）。2、5-azaC处理水稻幼苗：（1）6组种子分为6个实验组和1个对照组，实验组分别用20mg/mL，40mg/mL, 60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL5-azaC溶液处理，对照组用蒸馏水培养，共处理10天，每2天换处理液1次（第二 十一天）。（2）10 天后每个处理随机取10 株幼苗嫩叶混合提取DNA，其余麦苗移载大田并观察田间生长情况。2、植物基因组DNA 的提取与纯化改良CTAB法(Kidwell and Osborn, 1992)8（1）取不同处理的叶1g，将其在液氮中研磨成粉后转入50ml
11、离心管。（2）向离心管中加入等体积DNA 提取缓冲液(A:B:C=1:1:0.4混合，加1%PVP于B液)。（3）置于65恒温水浴下摇床，40-50rpm振摇90分钟。（4）加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1) ，轻轻上下颠倒10-15分钟后，4 3000rpm离心10-15分钟。（5）取上层水相加入2/3 体积的预冷异丙醇，上下颠倒5分钟并置4冰箱内10min。（6）待DNA 沉淀后于4 3000rpm离心收集DNA于管底。（7）DNA于70%乙醇中过夜。（8）取DNA沉淀并风干（第十二天）。（9）在2ml离心管中加1ml TE溶解沉淀。（10）待DNA 完全溶解后，加入5ul不含DNA酶的
12、RNA酶，37保温30分钟以除去DNA中的RNA。（11）加入等量氯仿: 异戊醇(24:1) 纯化DNA ，轻轻上下颠倒10-15分钟后，43000rpm离心10-15分钟。（12）取DNA沉淀，用70%乙醇过夜洗涤DNA，并将其溶于DNA 于200-500ul TE中。（13）取基因组DNA溶液，0.8% 琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据已知的DNA Marker（未酶切的DNA）估计其浓度；调整DNA 浓度，置于-20备用。3、水稻基因组DNA 酶切（1）甲基化分析采用两种甲基化敏感酶Hap和Msp（NEB）。在限制性酶切和连接前，先把两个单链的接头复性为双链结构( 序列见试剂部分)
13、，即100 变性5分钟，缓慢冷却至 室温，-20冷冻保存备用。（2）水稻MSAP限制性酶切和连接体系如下 ：表2 水稻MSAP限制性酶切、连接体系T4 10 x buffer2.5ulBSA (10mg/L)0.1ulEcoR I adaptor (5pM)0.5ulH/M adaptor (50pM)0.5ulEcoR I (20U/ul)0.5ulH/MMspI (10U/ul) 0.5ulHpaII (20U/ul) 0.25ulT4 ligase0.1ulGenomic DNA300ng20ul AFLP-Water补足总反应体积（3）混匀体系，37，6小时，8，4小时，4保存。（4）
14、共四个处理组，即水稻25mg/mL 处理组，水稻50mg/mL处理组，水稻100mg/mL 处理组，水稻对照组；每组分别用HapII/MspI双酶切，共需切8管（第十五天）。4、预扩增（1）预扩增：水稻AFLP 预扩增体系如右表(预扩增引物PCR引物部分)：混匀体系，按下列参数进行PCR 扩增反应 ：表3 AFLP 预扩PCR体系10 x PCR reaction buffer2.5uldNTPs (2.5mM)2ulEcoR I primer (5 uM)1ulH/M primer (5 uM)1ulTaq DNA polymerase (5U/ uL)0.2ulPCR water16.3ulDNA 模 板 （ 预扩增 稀释 产 物 ）2ulTotal volume25ul（2）PCR 程序 ：94预变性2min, 94变性30秒，56复性30秒，72延伸60 秒, 共进行30 个循环，最后72延伸10分钟（第十七天）。（3）根据检测结果，用0.1x TE buffer稀释预扩增产物1/101/40，作为PCR 选择性扩增的DNA模板。按以下参数进行PCR 扩增反应 ：表4水稻AFLP 选择性扩增体系10 x PCR reaction buffer1.5uldNTPs (2.5mM)0.6ulEcoR I primer (5 uM)0.6ul
