《中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)实验室检测20150609》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)实验室检测20150609（33页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中东呼吸综合征冠状病毒实验室检测 王文玲 中国疾病预防控制中心病毒病所 应急技术中心 2015年6月9日 参考标准 l 中东呼吸综合征冠状病毒 MERS CoV 实验室检测技术 指南 l WHO Laboratory Testing for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus interim recommendations revised September 2014 l US CDC Interim Guidelines for Collecting Handling and Testing Clinical Specimens from
2、 Patients Under Investigation PUIs for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus MERS CoV Version 2 MERS CoV感染标本采集对象 l 中东呼吸综合征冠状病毒感染疑似病例 临床 诊断病例及需要进一步研究的确诊病例 l 其它需要进行MERS CoV感染诊断或鉴别诊断 者 标本采集要求 1 从事MERS CoV检测标本采集的技术人员应经过生物安全 培训 培训合格且具备相应的实验技能 在标本采集过 程中 采样人员进行安全防护 2 住院病例的标本由所在医院医护人员在当地疾控机构专 业人员指导下采
3、集 3 密切接触者标本由当地疾控机构负责采集 4 根据实验室检测工作的需要 结合病程再次采样 采集标本种类和要求 l 呼吸道 上 下呼吸道 和其他样品 血清 尿液和粪便 尸检标本 l 每个病例应尽可能同时采集上 下呼吸道标本 下呼吸道 标本最佳 建议同时采集粪便和尿液标本 l 应尽可能采取发病初期和恢复期双份血清标本以确定是否 感染 双份血清样品间隔14 21天采集比较理想 第一份 血清应在发病第一周内采集 但单份样品的检测对于确定 疑似病例也有价值 如果只能采集一份样品 应该在出现 症状后至少14天采集 标本的保存 l 样品采集后应尽快送至实验室 运输过程需合 理 l 若呼吸道样品72小时以
4、上才能到达实验室 强烈 推荐将样品储存在 80 并使用干冰进行运输 应 避免样品反复冻融 l 从全血分离的血清应4 储存并运输 或用干冰 液氮冷冻并运输 由于无霜冰柜温度波动较大 应避免使用无霜冰柜储存呼吸道和血清样品 u 院内转运时 标本应该放置在耐用 防渗透的二级容器中进行转 运 为减少任何标本破 漏的风险 不要使用任何气动传输系统 来转运任何可能疑似患者标本 u 转运至CDC的MERS CoV标本应该充分包裹 转运时不能开盖或 分装标本 标本转运应该符合三重包装系统要求 内层是主要的 容器 一个可密封的标本袋缠绕以可吸收材料 第二层是防 水 防渗漏的容器 外层是用于转运的包装 MERS
5、CoV感染标本包装和运输 MERS CoV感染实验室检测方法 l核酸检测 为目前早期诊断 早期发现MERS CoV感染病例的 主要检测方法 采用Real time PCR 进行病毒核酸检测和诊断 患者呼吸道样本中扩增到特异性核酸 可确诊MERS CoV感染 传统RT PCR因易出现污染使用受限 但可以获得病毒基因 序列 l抗原抗体检测 IgM捕获法ELISA检测血清特异性IgM抗体 间接法ELISA或免疫荧光方法检测IgG抗体 利用假病毒进行中和抗体检测 MERS CoV的实验室检测靶标 1 目前病毒核酸的检测方法主要有 检测E蛋白上游 基因 upE ORF1b ORF1a N2基因四种 2
6、这些方法均高度敏感 推荐upE检测用于初筛 检 测ORF1b基因的方法不如针对ORF1a的方法敏感 但比其更加特异 N2基因检测具有较高的灵敏 性 3 另外 已确定了中东呼吸综合征冠状病毒基因组 中位于RNA依赖的RNA聚合酶 RdRp 和衣壳蛋 白 N 基因的几个适合测序验证的靶序列 巢式PCR普通PCR PCR产物电泳或测序 逆转录 获得cDNA 核酸提取 标本采集 PCR检测 荧光定量 PCR 实 验 方 案 待检样品 upE 特异性RT PCR检测 阳性 阴性 ORF1a RT PCR检测 阳性 阴性 确 诊 RdRp测序或N 测序阴性 抗原检测 抗体检测 病毒分离 阳性 实验流程 继
7、续采样 如有必要应 送样至有MERS CoV检 测经验的参比实验室进 行检测 入选病例 rRT PCR upE基因进行筛查实验 阳性阴性 rRT PCR ORF1a ORF1b或N基 因区进行确证实验 阴性 但如果临床和流行病学证据 充分 继续采样重复检测 阴性阳性 RdRp或N区测序实验 阴性 显示为其 他序列 显示MERS CoV 确诊病例 确诊病例 upE upE Fwd 5 GCAACGCGCGATTCAGTT 3 upE Rev 5 GCCTCTACACGGGACCCATA 3 upE Prb 5 FAM CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG TAMRA 3 ORF1
8、b ORF1b Fwd 5 TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT 3 ORF1b Rev 5 TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG 3 ORF1b Prb 5 FAM CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT TAMRA 3 ORF1a ORF1a Fwd 5 CCACTACTCCCATTTCGTCAG 3 ORF1a Rev 5 CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA 3 ORF1a Prb 5 FAM TTGCAAATTGGCTTGCCCCCACT TAMRA 3 N2 N2 Fwd 5 GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC 3 N2
9、 Rev 5 TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT 3 N2 Prb 5 FAM ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG BHQ 3 分子检测引物与探针 Y 3 56x 39 19 R2 0 988 1e6 1e4 1e3 1e2 荧光定量RT PCR检测结果判断 阴性 无Ct值或Ct为40 阳性 Ct值 37 可报告为阳性 Ct值在37 40之间的样本建议重做 若重做结果Ct 值 37 该样本判断为阳性 否则为阴性 MERS CoV核酸检测结果报告 在实验室要确认一个样本为阳性 需要满足以下 两个条件的其中一个 1 至少两种MERS CoV特异性PCR结果阳性 2 一种PCR结果为阳
10、性 另外一种PCR产物序列测序 与 MERS CoV序列相符 当针对MERS CoV的两种不同的检测方法结果不一致的 时候 应当采用反转录PCR扩增 对扩增产物进行测序以确 认检测结果 检测结果判读 阴性结果也不能排除临床病人的感染 一些因素可能产生 假阴性 包括 1 样本质量差 比如口咽等部位的呼吸道样本 2 样本收集的过早或过晚 3 没有正确的保存 运输和处理样本 4 技术本身存在的原因 如病毒变异 PCR抑制等 当PCR检测结果为阴性 但临床表现和流行病学特点提示 是MERS CoV感染时 可采用血清学方法进行检测 双份 血清标本能够满足血清学检测的要求 我国首例输入性中东呼吸综合征病例
11、的 实验室快速确诊 2015年5月27日晚10时世界卫生组织向中国卫生计生委通 报 韩国1例确诊中东呼吸综合征 MERS 病例的密切接 触者经香港入境广东省惠州市 5月28日下午 经广东省疾控中心对病例标本进行核酸检 测 初筛结果为阳性 样本接收时间 2015 5 29日凌晨1点40分 中国疾控中心 病毒病所 实验室确诊结果上报 2015 5 29日凌晨5点40分 疑似MERS CoV感染的实验室快速确诊 样本来源 KIM MYEONGSHIK 韩国 广东省惠州市 样本类型 鼻咽拭子 3份 血清 1份 采样日期 2015 5 28 实验室复核检测流程 BSL 3实验室 分装灭活 BSL 2实验
12、室 核酸提取 荧光定量RT PCR 三个靶标UpE ORF1b和N2 结果判定与报告 广东省CDC疑似MERS CoV感染的复核检测 UpE检测扩增曲线 ORF1b检测扩增曲线 N2检测扩增曲线 靶标鼻咽拭子血 123 UpE 34 1833 933 84No CtNo CtNo CtNo Ct25 51 ORF1b 35 8535 1634 73No CtNo CtNo CtNo Ct27 95 N2 31 2131 2730 7636 5No CtNo CtND21 34 疑似MERS CoV感染的送检样本复核检测 荧光定量RT PCR检测结果 Ct 值 结论 l 采用upE ORF1b
13、N2 三个靶标 进行三种荧光定量 RT PCR扩增 在对照成立的基础上 三管咽拭子 样本检测结果皆为阳性 l 基于N2靶标的荧光定量RT PCR扩增 血清标本 呈弱阳性 l 结论 广东疑似MERS CoV病人实验室检测确定 为MERS CoV感染阳性 上海辉瑞合作研发试剂盒 单管双靶标 应用验证 MERS CoV RNA双色检测试剂盒ORF1b upE FAM VIC 1 3 4 2 样样品编编号CT值值 1 阳性对对照 22 58 2 咽拭子样样 本 36 35 样样品编编号CT值值 3 阳性对对照 22 54 4 咽拭子样样 本 33 17 基于浊度仪和羟基萘酚蓝颜色变化的简单快速 和灵敏
14、的环介导逆转录等温扩增技术 RT LAMP检测方法的特异性浊度图和显色图 特异性高 检测下限分别为每管反应500与1000拷贝 有 望应用于MERS CoV感染的快速筛选 具有在基层医疗卫生 机构和现场推广和应用的潜力 RT PCR扩增RdRp或N基因后测序检测 MERS CoV RdRpSeq assay EMC SeqRdRP Rev GCA TWG CNC WGT CAC ACT TAG G EMC SeqRdRP Fwd TGC TAT WAG TGC TAA GAA TAG RGC EMC SeqRdRP Rnest CAC TTA GGR TAR TCC CAW CCC A W A
15、 T N A C T G R A G Fragment size first round 242bp including primers second round 228 bp including primers Nseq assay EMC SeqN Fwd CCT TCG GTA CAG TGG AGC CA EMC SeqN Rev GAT GGG GTT GCC AAA CAC AAA C EMC SeqN Fnest TGA CCC AAA GAA TCC CAA CTA C Fragment size first round 306 312 bp including primers
16、 second round 279 285 bp including primers Reference Corman M ller et al Eurosurveillance Volume 17 Issue 49 06 December 2012 通用引物检测冠状病毒 冠状病毒通用引物RT PCR扩增产物电泳 One step RT PCR assays OneStep RT PCR kit QIAGEN 反应条件 1 反转录 50 for 30min 2 PCR扩增 95 for 15 min 激活 50 cycles 30 sec at 94 30 sec at 48 1min at 72 最后延伸 72 for 10min 引物对序列 Cor FW 5 ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC 3 Cor RV 5 TCRCAYTTDGGRTARTCCCA 3 IFA抗原片检测MERS CoV特异抗体 中和抗体检测 利用MERS CoV假病毒体系进行中和抗体检测 实验操作简单而 不受BSL 3实验室的限制 Virology Journal 2013 10 1 266 中
