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1、. . .硕 士 学 位 论 文题 目 脂肪酶脱脂性能及方法研究 作 者 侯爱军 完 成 日 期 2011 年5月 培 养 单 位 四 川 大 学 指 导 教 师 彭必雨 教授 专 业 发酵工程 研 究 方 向 酶工程及应用 授予学位日期 年 月 日 .专业资料. . .脂肪酶脱脂性能及方法研究发酵工程专业硕士生：侯爱军 指导老师：彭必雨 教授摘 要近年来，制革工业中酶法脱脂得到了许多关注和实际应用，并被认为是一种绿色、具有较大潜力的脱脂方法。但是，关于皮革酶脱脂的研究大多局限于对一些脂肪酶脱脂效果的评价，并且在对脂肪酶脱脂的性能和效果的认识上存在着一些分歧，缺乏较系统的研究，人们在使用酶脱脂
2、法时缺乏理论指导，存在着一些盲目性。针对上述问题，本论文较系统地研究了制革条件下脂肪酶脱脂的性能和方法。首先，建立了一种更适合制革条件下的脂肪酶活力的检测和脂肪酶性能的评价方法改进型铜皂-分光光度法，并采用该方法对制革常用的几种脂肪酶的基本酶学性能进行了评价，考察了它们的最适pH值、最适温度、热稳定性和与制革工序中常用助剂的相容性，为这些酶对于制革过程中工序的适应性选择提供了依据；其次，为了克服以油脂为底物模型研究脂肪酶性能的结果不能与皮革脱脂过程的实际情况相匹配、以皮和皮块为底物，由于原皮的部位差，导致实验结果的重复性差的问题，开发了一种以富含油脂的绵羊皮粉（均匀性好）为底物、以脂肪酶作用前
3、后皮粉油脂抽提物酸值的变化为脂肪酶对皮内油脂水解程度的评价指标、以皮粉油脂抽提物量的减少为脱脂效果的评价指标的脂肪酶脱脂性能和效果的评价方法体系；以新的评价方法对几种常用脂肪酶的性能、脱脂条件、脱脂效果、脱脂方法和酶脱脂机理进行了研究，主要包括酶的种类、用量、作用时间、作用pH对皮内油脂水解程度的影响，并研究了脂肪酶作用和表面活性剂、有机溶剂、碱洗等方法结合的协同脱脂效果。主要实验结论如下：（1）改进铜皂-分光光度法的线性范围为OD值0.154-0.291之间，结果的重复性优于滴定法。新方法避免了滴定法中乳液颜色、缓冲溶液的缓冲性对滴定的影响、避免了一般铜皂法中苯等有害溶剂的使用及离心等繁琐操
4、作。新方法对几种脂肪酶的性能测定结果表明：碱性脂肪酶UG、G20和磷脂酶A的最适pH为7.0-9.3，酸性脂肪酶AD的最适pH在3.0-5.0；在20-40范围内，UG、G20和AD的活力随温度的升高几乎线性的增加，磷脂酶A的最适温度在30-35之间；几种脂肪酶在相应的最适pH条件下30保温，48h内活力变化较小；脂肪酶UG和G20与防腐剂、螯合剂和蛋白酶等各种助剂具有较好的相容性，在实验条件下24h后脂肪酶残余活力剩余50%-70%。这几种酶和制革过程中的浸水、脱灰和软化等工序中常用助剂有较好的相容性。（2）新鲜绵羊盐湿皮通过不加表面活性剂和碱、只加防腐剂的浸水后，采用As1.398肉面涂酶
5、堆置脱毛，脱毛后的皮板自然干燥后粉碎制得富含油脂的绵羊皮粉。该皮粉油脂含量较高、且均匀，油脂的酸值低，适合作脂肪酶作用的底物。（3）脂肪酶对皮粉内油脂的水解程度酸值随脂肪酶用量的增加表现出先增加后不变的特点，最大油脂水解程度为57%-67%之间，临界脂肪酶浓度约为10U/ml；脂肪酶对皮内油脂的水解初始20min内反应较快，之后反应变慢，60min后反应趋于平衡，即脂肪酶对皮粉内油脂不能完全水解，水解到一定程度后，通过增加酶的浓度和延长反应时间并不能有效增加油脂的进一步水解程度。脂肪酸对脂肪酶活力的影响实验结果表明：脂肪酶酶水解过程有明显的产物抑制作用，生成的脂肪酸积累于油水界面对脂肪酶产生较
6、大的抑制作用，且该作用是阻碍皮内油脂进一步水解的主要原因之一。（4）碱性脂肪酶UG和G20的最适pH为8.0左右，尽管在该pH下酶对油脂的水解程度最大，但皮内油脂内物质的总量几乎不减少，因此，单独的脂肪酶作用，并不能有效除去皮内的脂类物质，其原因是酶处理生产的脂肪酸不能通过水洗去除。在0.5%的碳酸钠溶液在30条件下对脂肪酶作用后皮粉振荡30min几乎可完全除去皮粉中的脂肪酸，脱脂率约为66%。0.5%的脱脂剂BE/C和0.1%的表面活性剂LAS对脂肪酶作用后皮内油脂的去除率都不高，脱脂率分别约为50%和30%。先用碳酸钠去除脂肪酶作用后皮粉内的脂肪酸，再用BE/C进行脱脂，则脱脂率可提高至7
7、5%左右。（5）脂肪酶和表面活性剂结合使用，在较低浓度下（表面活性剂浓度低于0.02%），大部分表面活性剂对脂肪酶G20有激活作用，但当表面活性剂的浓度超过0.05%时，表面活性剂对酶显示较强的抑制特性。表面活性剂对脂肪酶活力的影响主要取决于表面活性剂在油水界面的吸附情况，与表面活性剂的浓度有较大关系，而与表面活性剂优先与酶或优先与底物接触等表面活性剂的不同使用方式关系不大。表面活性剂对皮内油脂的酶水解的促进作用由大到小依次为：A-BOLASXL70XL50，对油脂的去除能力由大到小依次为：AEO-9XL50XL70A-BOLAS。A-BO既对脂肪酶对皮内油脂的水解有明显的促进作用，又对皮内油
8、脂有一定的去除能力，相对而言，是一种比较合理的酶脱脂用协同表面活性剂。10#白油与AEO-9的复配物能有效的提高AEO-9对脂肪酸的去除能力，但是复配物的渗透速度变慢。关键词： 脂肪酶 酶脱脂 制革Leather biotechnology - degreasing properties of lipase and MethodsFermentation EngineeringPostgraduate: Hou Aijun Supervisor: Prof. Peng BiyuA modified colorimetric method for assaying lipase activity
9、 was developed, and the effects of pH, temperature and the common leather additives on the lipases and thermal stability of the lipases were studied by the new method. Then, a uniformity sheepskin powder rich of fat was manufactured as the substrates of the enzyme degreasing, and the effects of degr
10、easing and lipase hydrolysis were estimated according to the change of the amount of dichloromethane extract and its acid value. According to these, the process and mechanism of enzyme degreasing were studied in detail. The effects of enzyme dosage, reaction time and pH on the oil lipolysis in the s
11、heepskin powder and the efficiencies of the removal of fat using alkali, surfactant or the joint of the two to clean the sheepskin powder after treated with lipase were studied. Finally, the synergetic degreasing of Surfactant, organic solvent and lipase was studied.Through the above experiments, th
12、e main experimental results are as follows: 1) The linear OD range of the modified colorimetric method is 0.154-0.291. The reproducibility of the method is about 1.5%, better than the titration method. The new method does not need to titrate the emulsion, avoids the impacts of the color of emulsion
13、and buffer to the titration and avoids the use of benzene and centrifugation which is necessary in the general copper soap method. The optimum pH, optimum temperature and other performances of the lipases were determinated by the modified colorimetric method, and the experimental results show that:
14、the optimum pH of lipase G20,UG and phospholipase A is in the range of 7.0-9.30, and the optimum pH of acidic lipase AD is in the range of 3.0-5.0; at the range of 20-40, the activities of lipase UG, G20, AD increase almost linearly with increase of temperature, but the optimum temperature of phosph
15、olipase A is in the range of 30-35; the thermal stability of various lipases is good in 48h, when 20U/ml lipase was being incubated at the conditions of optimum pH, 30 ; lipase UG or G20 and preservatives, chelating agents, protease, and other additives have good compatibility. Under experimental conditions, the residual enzyme activity is remaining 50% -70% after 24h. Especially, the compatibility of lipase and preservatives FMN or bating enzyme PTN110 is the best, of which the residual activity is basically un
