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1、编制说明项目名称：动物垫料中金黄色葡萄球菌检测方法 项目编号：内质监标函（2018）154号-105 编制单位：呼和浩特海关 编制时间：2019.3-2019.9 一、 工作简况本标准根据关于下达2018年第一批内蒙古自治区地方标准制修订项目计划的通知内质监标函（2018）154号制定，本标准是由呼和浩特海关提出并归口，项目计划编号为105。呼和浩特海关牵头成立由相关领域的专业技术人员和具有标准化专业知识的人员组成的标准起草组。起草组在充分调查研究、综合分析和试验验证的基础上，起草标准初稿和编制说明，并广泛征求意见。对意见进行汇总整理，修改完善标准初稿，形成地方标准征求意见稿。第一起草单位：中
2、华人民共和国呼和浩特海关；第二起草单位：呼和浩特国际旅行卫生保健中心；第二起草单位：二连浩特海关。主要起草人：赵治国、陈林军、韩祎陟、崔强、敖威华、延涵、王海艳、杨帆、盛万里、马彩霞。二、标准制定的背景及意义动物垫料与动物关系密切。近年来随着生物科学研究的飞速发展，动物作为其研究中不可缺少的重要组成部分，备受各国政府的重视和科学家的关注。垫料是为动物营造舒适的人工环境，进行环境控制的基础条件和必要材料，是对动物产生直接作用和影响的环境因素。动物垫料与动物健康、福利息息相关，同时也对养殖业、动物及其相关科研方面甚至社会经济发展有十分重大的影响。因此，垫料的质量评定与控制非常必要。我国动物垫料标准
3、化、商品化尚处于初级阶段。欧美等发达国家早已实行垫料商品化生产，有专业的工厂，并且各道工序的质量要求非常严格。但我国对动物垫料的研究还处于初级阶段，与垫料相关的文献报道甚少，垫料生产监管环节薄弱，检测标准缺乏。近年来我国政府及从业人员逐渐认识到动物垫料中存在的问题，开始对垫料质量评价方面的问题进行改进。因此要想使动物的质量管理与国际接轨，动物垫料生产的标准化、商品化就变得至关重要。我国动物垫料标准化和质量管理相对滞后，影响相关行业发展。我国对动物垫料的研究才刚刚起步，现行的国家标准和实验动物相关管理条例中，对动物垫料的标准化规定几乎空白，稀数资料对于垫料的规定只有：应选用吸湿性好、尘埃少、无异
4、味、无毒性、无油脂的材料；须经消毒、灭菌后方可使用。如此笼统的规定在一定程度上制约了我国动物垫料标准不能紧跟国际标准，同时限制了药品、生物制品、动物等产品的出口，还使科研论文将不能被同行接受。因此要想提高相关学科竞争力，就必须加强垫料标准化和质量管理，从动物垫料微生物指标监测入手。我国动物垫料微生物检测标准几乎空白，亟待建立相关标准。近年来，我国政府及从业人员逐渐认识到动物垫料对动物健康及下游产业的重大意义，垫料相关研究报道逐年增多，积累了一定的理论基础。但目前，我国尚未对国内垫料质量建立统一评价体系、风险分析、国家标准及配套法规。其中，垫料中微生物特别是致病微生物的含量对动物健康、福利和产品
5、等影响重大，但目前动物垫料中微生物检测标准属于空白，亟待建立科学完善的动物垫料微生物检测标准，该工作将对国内垫料建立统一质量评价体系、风险分析及产品标准等有力促进。动物垫料污染金黄色葡萄球菌是影响动物健康和动物实验结果的国际公认的重要环境因素之一，因此动物垫料中金黄色葡萄球菌的检测十分重要。金黄色葡萄球菌属于葡萄球菌属，革兰氏阳性菌，需氧或兼性厌氧，能耐受干燥和低温，在干燥的环境中可生存数月，对热具有较强的抵抗力，70需1h才被灭活；其是一种重要的人兽共患病原菌，一种寄生于宿主体表的条件致病菌，食品中的重要微生物检测指标，能够造成食品污染、引起细菌性食物中毒，在冷冻食品、动物性食品和蔬菜制品、
6、粮食制品等食品中常有检出。金黄色葡萄球菌广泛分布于土壤、空气、水等自然环境中。金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要病原，由于其极易产生耐药性，使得治疗变得相当困难。奶牛乳房炎是对世界奶牛业造成经济损失最大的疾病之一，它不仅直接导致乳品工业的经济损失，而且由于患乳房炎的奶牛其乳汁中经常含有大量的毒素、病原微生物以及治疗后残留的抗生素，使得该病日益引起公众的关注。金黄色葡萄球菌为侵袭性细菌，进入机体能产生毒素，对肠道破坏性大，主要表现为呕吐、发热、腹泻。常见的皮肤感染，绝大部分是由金黄色葡萄球菌感染造成的。此外，这种细菌也有能力造成侵袭性感染；另外，肺炎与脑膜炎虽然较少见，一旦发生则可能造成死亡。除细
7、菌本身以外，细菌产生的毒素也会造成严重症状，如中毒性休克综合征、葡萄球菌性猩红热、食物中毒等。世界卫生组织指出，在全球引起发病和造成死亡的疾病中，肺炎位列为第三，在儿童和老年人群中，肺炎仍是致死的主要原因之一；而这其中，头号杀手就要数金黄色葡萄球菌了，近年来，它越来越不受抗生素的抑菌或杀菌作用，表现出多重耐药性。金黄色葡萄球菌病的危害如此之大，使用金黄色葡萄球菌污染的垫料容易引起动物发病，含有金黄色葡萄球菌的动物产品又会导致公共卫生事件的发生。动物机体传播的金黄色葡萄球菌，也可能污染食物导致人的食物中毒。因此检测垫料中金黄色葡萄球菌成为重中之重。建立动物垫料金黄色葡萄球菌检测标准，保障动物健康
8、急不可待。动物垫料与动物排泄物直接接触，容易滋生细菌，尤其是致使垫料被金黄色葡萄球菌污染，从而威胁动物的健康与福利，并且对养殖业的发展与国际间动物及产品贸易带来巨大的影响，甚至威胁到人类社会的生产与生活。但是对于动物垫料金黄色葡萄球菌检测标准几乎空白，还没有统一的标准和方法，所以建立动物垫料金黄色葡萄球菌检测标准已刻不容缓。本实验室具有多年微生物检测的经验，本方法的开发和应用，在检测技术方面填补我区的空白、弥补了自治区没有现行标准的不足，能够使动物垫料中金黄色葡萄球菌的检测更加高效、准确、安全。本方法的开发和应用将会使我区在动物垫料中金黄色葡萄球菌的检测先进性方面达到国内领先水平，为我区动物垫
9、料质量安全管理部门更快更好的管控提供可靠保障。因此，加强动物垫料中金黄色葡萄球菌的检测对确保全区农业持续、健康发展具有重要的现实意义。三、主要起草过程2018.05-2018.08 地标前期基础工作：收集动物垫料样本，查阅金黄色葡萄球菌资料，检索金黄色葡萄球菌检测的相关文献及标准。2018.10-2019.09 前期实验条件的摸索：包括前处理方法的优化、对照，不同垫料中金黄色葡萄球菌的检出率，最终确定实验方案，编写编制说明。2019.10-2019.11 验证单位进行验证。2019.12 编写地标并定初稿。四、现行法律、法规和强制性标准的关系本标准遵循GB/T 1.1-2009 标准化工作导则
10、 第1部分：标准的结构和编写和GB/T 20001.4-2015 标准编写规则 第4部分：试验方法标准的规则编写。还参照相关国家标准编写指南的要求。在编制本标准的过程中参考了以下标准：GB 4789.10-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验、GB 14925-2010实验动物环境及设施、GB/T 14926.14-2001实验动物 金黄色葡萄球菌检测方法、ISO 6888:2003 MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING STUFFS HORIZONTAL METHOD FOR THE ENUMERATION OF COAGU
11、LASE-POSITIVE STAPHYLOCOCCI (STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND OTHER SPECIES) 、 美国FDA细菌学分析手册第八版（BAM） 金黄色葡萄球菌；综合参考了国内外与金黄色葡萄球菌检测相关的检测标准，力求该标准能够高效准确的检测动物垫料中金黄色葡萄球菌，同时兼顾标准的广泛应用。本标准完全符合现行法律法规和强制性标准规定，不存在任何与现行法律法规和强制性标准相违背之处。相关强制性标准1项：GB 14925-2010 实验动物 环境及设施，本标准规定了实验动物及动物实验设备和环境的技术要求及检测方法，同时规定了垫料、饮水和笼具的原则要求。但针对
12、垫料该标准仅规定了“垫料的材质应符合动物的健康和福利要求，应满足吸湿性好、尘埃少、无异味、无毒性、无油脂、耐高温、耐高压等条件；垫料必须经灭菌处理后方可使用”。本地标适用于垫料中金黄色葡萄球菌检测，明确规定了不同类别垫料取样方法，标准中金黄色葡萄球菌鉴定过程增加了新的鉴定手段，确保检测结果更加准确。5、 主要内容及检测方法的确定5.1 取样方法的确定及优化根据动物垫料的物理性状将其分为颗粒状/粉末状垫料和平面状垫料，针对不同性状的垫料采取不同的取样方法。5.1.1 颗粒状或粉末垫料样品取样方法国内外食品和饲料中金黄色葡萄球菌检测法中常用的取样方法为称取法，本标准中针对颗粒状或粉末垫料样品（木屑
13、、玉米芯、秸秆、纸屑等）参考通用做法采用称取25 g的方法进行取样，制成检样。5.1.2 平面垫料样品取样方法针对平面垫料（胶垫、托盘等）采用表面涂抹取样法，无菌操作将涂抹25 cm2-100 cm2平面样品的棉拭子置入装有 25 mL-100 mL 生理盐水中，振荡混匀作为检样。5.2 预增菌液和培养基的选择5.2.1 预增菌的选择国内外标准和资料中用到的预增菌液主要有：SCDLP液体培养基和7.5%氯化钠肉汤等。不同标准中使用最多的是7.5%氯化钠肉汤，本标准也选用该预增菌液。5.2.2 分离培养基本标准选用的金黄色葡萄球菌分离培养基均为国内外标准中比较认可的Baird-Parker平板培
14、养基、血琼脂平板、金黄色葡萄球菌显色平板，保证检测结果的同时，兼顾不同标准所用培养基的一致性，节约实验室成本。自上述增菌培养液中，取12接种环，划线接种在Baird-Parker平板置361培养24 h48 h；取12接种环，划线接种在血琼脂平板置361培养18 h24 h，如无此培养基也可划线接种到金黄色葡萄球菌显色平板，置361培养18 h24h。在血琼脂平板上菌落呈金黄色，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈；在Baird Parker平板培养基上为圆形，光滑，凸起，湿润，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明带；在金黄色葡萄球菌显色平板上，菌落形态按照显色培养基
15、的说明进行判定。挑取单个菌落分纯在营养琼脂平板上，置361培养24h2h。 5.3 典型或可疑菌落的鉴定本标准对典型或可疑菌落的鉴定过程，参考了国内外金黄色葡萄球菌检测标准和药典等成熟做法，综合了生化反应等必要鉴定过程，并囊括了全自动微生物检测系统和飞行时间质谱检测方法，做到了与国际接轨，缩短检测时间，增加检测通量，减少检测人员工作量。5.4 培养时间和温度最新的美国美国FDA细菌学分析手册第八版（BAM）将常用的的预增菌温度调整，使金黄色葡萄球菌培养温度范围扩大为为3537，而我国常用的金黄色葡萄球菌培养温度为361，也在这一范围内，本标准将继续采用我国常用的361对金黄色葡萄球菌进行检测培养。本标准各种培养基培养时间也与过内外标准常用时间相统一。六、方法验证为验证本方法的有效性和适用性，选择5家检测机构对本方法进行验证，验证内容为方法的适用性、准确度、检出率及相关样品的检测，结果显示该方法稳定可靠，符合相关要求。七、结论综上所述，本标准在制定过程中所涉及到的各项技术指标均经过方法学的验证，并切实可行，完全达到了编制标准的要求。八、重大意见分歧的处理依据和结果未发生。九、国内外情况简要说明国内尚没有建立统一的国家标准检测方法。检索国家标准1项和地方标准2项：GB 14925-2010 实验动物 环境及设施、江苏省地方标准DB
