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1、.专业整理.（一） 基因组DNA提取上海博彩生物科技有限公司：3S DNA Isolation Kit for Environmental Samples V2.2 3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒 V2.2DNA抽提方法使用仪器：灭菌锅，无菌操作台，移液枪，漩涡振荡器，台式离心机，水浴锅，分光光度计或者琼脂糖电泳槽灭菌物品：枪头，1.5ml，2ml离心管一、污泥样品前处理样品在处理前首先要混匀，使其中的悬浮物质分布均匀。取约l0mL污水样品，加入灭菌离心管，400Orpm、离心20min，收集沉淀，加约4倍体积的TENP buffer(50mMTirs，20mM EDTA，100mM N
2、aCl，0.01g/mL PVP，pHl0)，加玻璃珠(d:l mm)充分匀化(解絮凝)。4000rpm，离心20min，弃上清(重复两次，直至上清液较澄清)。加约4倍体积的PBS buffer(8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于lL水、pH7.4)，旋涡混匀，4000rpm，离心20min，收集沉淀(重复两次)二、基因组DNA提取1. 样品准备： 100mg样品用200ul Solution SUS 将样品浸泡、悬浮，使样品软化分散开。2. 加入400ul Solution LYS，300mg石英砂，盖上离心管盖，在漩涡振荡器上高速剧烈
3、振荡，10-30min或更长时间。3. 用台式离心机，12000rpm，室温离心5min。4. 将上清液完全转移到无菌1.5ml离心管中，加入120ul Solution BID，盖上离心管盖，上下颠倒混匀。将溶液用1ml TIP全部转移到3S柱内，柱子放入2ml离心管中，不盖离心管盖，室温放置2min以上。5. 盖上离心管盖，12000rpm，室温离心1min。6. 取下3S柱，弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中，加入600ul Wash Solution，10000rpm，室温离心1min。7. 重复6一次。8. 取下3S柱，弃去离心管中的全部废液。将柱子放回同一根离心管中，10
4、000rpm，室温离心2min，以除去残留的Wash Solution。9. 洗脱：在柱子中央加入100ul TE，将柱子放入新的干净1.5ml离心管中，室温放置2min。12000rpm，室温离心1min。收集管中的液体即为基因组DNA。根据用途，样品可以4或-20保存。为提高洗脱效率，可以将TE预热到37-55。如果样品中基因组DNA含量很低，用30ul TE洗脱可以提高洗脱液的样品浓度，但产率有所下降。重复该洗脱步骤一次，可以提高产率20%左右。三、提取DNA的质量检测(1)DNA纯度和浓度检测用紫外分光光度计测定DNA样品在波长230，260，280nm处的吸光光度值。DNA纯度的定性
5、检测:通过A260/A280及A260/A230的比值可以检测所提DNA是否纯。通常纯DNA样品A26O/A2801.8，A260/A2302。若A260/A280l.9，可能有RNA污染；若A260/A280l.6，可能有蛋白质污染；若A260/A2302，可能存在酚类等小分子杂质。DNA浓度的计算：浓度(g/mL)=A260*50*稀释倍数；注：1OD值相当于50 g/mL双螺旋DNA。(2)DNA琼脂糖凝胶电泳检测将所得DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电泳lh，EB染色后，用紫外凝胶成像系统拍照。 .学习帮手.（二）PCR扩增一、PCR扩增引物采用两组对大多数细菌和古细菌
6、的16S rRNA基因V3区具有特异性的引物对：组合(F34，GC和RS:8)。引物组合的正向引物5端中有一个富含GC的40bp的GC发卡结构。它们各自序列分别为:F341:(5一eCTACGooAooeAGeAo一3)，Rsls:(5一ATTACCGCGGCTGCTGG一3，)，GC发卡结构(5一CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG一3)。引物组合扩增产物片段长度约为220bp。二、PCR扩增反应体系PCR扩增反应体系，与表3一3相同。加样后立即进行PCR扩增。三、PCR扩增程序PCR扩增程序，与表3一4相同。四、PCR产物电泳检测取5闪PCR产物
7、进行电泳，胶浓度为2.0%，在电压100v条件下电泳lh后检测，经EB染色后用凝胶成像系统观察，保存凝胶图谱。电泳所用Marker为天根生化科技(北京)有限公司生产的nNAM叭e:nLZo00。.专业整理.（三）变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析预电泳的作用1.使体系达到反应的条件2.清除过多的变性剂和APS等，保持胶的稳定状态。聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分 析。其装载的样品量大，回收DNA纯度高。长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，
8、N，N一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N一亚甲 双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。一、试剂配制(l)50*TAE缓冲液:242g Tris碱，57.1mL冰醋酸，100mL0.5M EDTA(pH8.0)，加水至1L。混合均匀后高压灭菌20-30min，室温保存。(2)40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺(37.5：1)：38.93g丙烯酰胺，1.07g双丙烯酰胺，加水至100mL。(3)O%变性溶液：20mL40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺，2mL50*TAE缓冲液，加水至100mL，再分别加入80L APS和5L TEMED。4条
9、件下保存在棕色瓶中。(4)100%变性溶液：2OmL40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺，2mL50*TAE缓冲液，40mL甲酰胺，42g尿素，加水至100mL，再分别加入80L APS和5L TEMED。4条件下保存在棕色瓶中，100%变性溶液在使用之前需要预先溶解，把瓶子放进水浴锅中加温并快速搅拌。(5)10%过硫酞胺(APS)：lg过硫酰胺加水至10mL。现用现配。(6)对于变性浓度低于100%的溶液，用0%和100%的变性溶液混合配制而成，尿素和甲酰胺含量如下所示：不同浓度的变性溶液尿素、甲酰胺含量成分10%20%30%40%50%60%70%80%90%尿素（g）4.28.412.616.82
10、125.229.433.637.8甲酰胺（ml）4812162024283236二、DGGE胶的制备(l)用无水乙醇清洁制胶用的两块玻璃板，将spacer放在2个玻璃板之间，插入clamp中，将aligment板放入，用螺丝夹子固定，将aligment取出，用手摸底部是否平整，要绝对的平，否则会漏。(2)将软垫放在底座上，玻璃板放在软垫上固定，用水平器调节。(3)配制13.5mL高浓度变性梯度液，加入梯度仪高浓度右槽，打开左槽螺旋，溶液流入左槽，关上螺旋，用吸管将它们吸回右槽内(确保两槽无气泡阻隔)。(4)配制13.5mL低浓度变性梯度液，加入梯度仪低浓度左槽。(5)轻轻打开两槽间的活塞和梯度
11、仪出口开关，并搅拌。将长针头插入玻璃板之间，流速保持在2mL/min左右。(6)胶板灌满后，顶部插入梳子，凝固2小时。三、DGGE凝胶电泳步骤及染色(l)在DGGE槽中加7L左右1*TAE(DGGE专用)，使槽中的水至Full和Run的中间位置；加盖，注意长杆进入底部的窟窿中，打开电源，将温度设置到60，打开heat键。(2)当梳子位置的胶凝固好后，将玻璃板固定在黄色的凝胶板架上，如果只有1板胶，注意另一侧也要固定玻璃板(不加spacer)，否则漏水。安装好玻璃板后，将凝胶板架(红点在右边)放入水槽中，之后将温度控制器盖在电泳槽上，注意长杆进入底部的窟窿中。打开电源，打开heat键和bump键
12、，开bump键后，水位会下降，降至run与maxmum的中间，水若不够的话，关闭电源，打开温度控制器上方的探望口，加1*TAE补足。(3)温度达到60，立即进样，先关掉所有电源，取下温度控制器，小心地拔掉梳子，用移液枪冲洗侮一个进样孔；进样要缓慢，使样品顺着玻璃板均匀地落入到进样孔中。每一个进样孔加入25L样品。(4)将温度控制器盖在电泳槽上，打开电源，将温度调到60，打开heat键和bump键，运行5min后，在主机上插入红黑电源线，注意红黑线不要颠倒。打开主机电源，将电压调到120V，时间调为5h。(5)电泳结束后，关掉电源，打开盖子，将凝胶板架拿出，控水，卸下玻璃板。将clamp卸下，手
13、抓住spacer，向内侧拧，揭下短玻璃板，胶粘在长玻璃板上。(6)将托盘上平铺张保鲜膜后，将长板和胶放入托盘中银染。银染步骤步骤：时间溶液固定30 min10%冰醋酸、30%乙醇，100 ml敏化2*10 min30%乙醇，100 ml洗涤冲洗30 s，漂洗5*5 min双蒸水银染30 min新鲜配制的0.1%AgNO3，100 ml，使用前加入370 l的福尔马林溶液洗涤冲洗30 s，漂洗1 min，再冲洗30 s双蒸水显影直至显示条带为止，密切观察溶液1：0.2 g硫代硫酸钠于10 ml水中溶液2：2.5 g碳酸钠于100 ml水中将100 l溶液1加入溶液2中，再加350 l的福尔马林溶
14、液终止30 min5.84 g EDTA2Na2H2O以及8 g Glycine于双蒸水中，定容至400 ml（也可用10%的冰醋酸）保存长达数日10%甘油长时间保存干胶自然干燥即可（1） AgNO3母液（20%）：将2 g AgNO3溶解于双蒸水中，定容至10 ml，放置于棕色瓶中密闭保存。每次使用时取2 ml母液，稀释至400 ml，再加入福尔马林。（2） 10*Tris EDTA（TE）：pH=8.0A100mmol/L Tris-CI（pH=8.0）B10mmol/L EDTA (pH=8.0)CTris-Cl(1 mol/L)：用800 ml蒸馏水溶解121.1 gTris碱，加浓盐
15、酸调pH值至所需值。银染原理：银染是一种常用的蛋白质染色方法，具有较高的灵敏度，可以染出SDS-PAGE胶中含量低至0.2ng的蛋白。虽然这是protocol上的说法，但如果操作得当，检测到5ng左右的蛋白应该不成问题。如果搜索银染的protocol，可能会得到许多种说法。为什么这样一种重要的实验手段却得不到统一的应用呢？这可能要从银染本身那复杂而又灵活的原理说起。简单的讲，银染的原理就是将银离子还原，附着在蛋白表面，形成染色。银染所用的银，基本上是基于两种试剂，一种是硝酸银，另一种是Silver diammine。基于硝酸银的应用要多于后者（据说Silver diammine比较费“银子”），现在主要说说基于硝酸银的银染的原理。银离子容易被还原，在PAGE胶上，哪里的银离子先开始被还原，哪里就先开始出现条带。通常由于蛋白质结构上的复杂性，一部分银离子结合在蛋白质之上后会影响更多银离子的结合，所以有蛋白的地方银离子较少，如果不做任何处理，有蛋白的部位将会染色更浅，所以最初的银染是负染。那最初的负
