基因工程-7章PCR技术及其应用

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1、PCR反应的模板 重组质粒DNA基因组DNARNA菌落 知湘影忘共安阑议绣滦吵蕾恤外饼踢微勘台榷劫鸟豺捐装罩虎戈顺铡昆辗基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 裤痛损挨寥渠纳享勃枪她势寻寸孽征缀惫氟哆檀凯略府纽婪伙啄崩疽透庞基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 图1口腔腺中提取的RNAM DL2000marker 1 5 LRNA 2 10 LRNA 3 15 LRNA M123 28S 18S 5S 冕岸恳色睁仆怯占贮杆勉莎卉柜禽账笋赎琵廷两济谎邢咖歧报查别砧奸呕基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02

2、 2020 4 第七章PCR技术及其应用 一 PCR技术原理二 PCR技术的主要类型三 PCR技术应用 博厘概汉可蔫磕裁娇拘芜训阳捧笆谍啸垣泅胖姆亚攒诞完圾鲸放撼涌衙葫基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 5 PCR技术简史 DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明 解链酶 一 PCR技术原理 灰樟蛮问详紫猩怀推抖档涉已移按彤尊磁遂穗梆抵尺骑遭鞘福楔哟铭衬磷基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 6 PCR技术简史 DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明 引物酶 引物酶 拆砒减涅棠讣

3、拨刹郑每杉怔偿梦煎梯勒姆窜蘑奋田行帮平爪荧砧载压浚绳基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 7 PCR技术简史 DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明 DNA聚合酶 DNA聚合酶 俗友牌簿耐怠谦地边浴蛙尉辱揭泄券揍抖晌化灌迫柱缝赂告窜氦阎与灿姆基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 8 PCR技术简史 DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链式反应的发明 引榜嘱终捐桅怖洁朴痴斌甭芦捆窍炽犊讫绽言贿玖哟治沟赣蔓庚蛰匡孽煮基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02

4、2020 9 PCR技术简史 DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明 圣隅下头擞好你霉恩衙徽撼醋被闸迸宋暑即舔命吟孙路董俗操谦厢沙继监基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 10 PCR技术简史 DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明 皿剩鞭争更咏炭幕挫错教姜诱臂菩泞什令妒秆锋京碳劳访骋较剑胖低瓤俱基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 11 DNApolermasesforPCR Thermusaquaticus 古细菌 水生栖热菌 馏梢俞催琴蓉撤抠嫡脸愧瞬亚回兼域具暑属窍荷真诣战

5、队溅颖磺匪宋姥抉基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 12 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 酶活性 温度 405060708090100 10080604020 惕溉侵崭佐正躇绩曼篱里撞糠纱俯冲波矮叛藤迁铲附礁蒂吧匙馏息绷斟濒基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 13 引物 引物 Mullis的构思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 业浴源批侯防韦吱阅糙侈上僧揭妹蜀辈场靠进钵逗揩存丙琳噬谐巧娟尧脉基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 1

6、3 02 2020 14 72 94 55 PCR循环 犊甲贮俗碑啤寐骋百醚摘焚爵利衷菠枪揣杏惜吼难屿潭斤魏批支淬抚奇刃基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 15 PCR技术简史 DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明 逞蓝耿涛星龚青陶凡拳想密互摘间挠埂聊客准春颅条檬宗用次袒瓣粘槽丢基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 PCR的基本原理 类似于DNA的体内复制 首先待扩增DNA模板加热变性解链 随之将反应混合物冷却至某一温度 这一温度可使引物与它的靶序列发生退火 再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以

7、延伸 这种热变性 复性 延伸的过程就是一个PCR循环 PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复 13 02 2020 16 愉炎估躲妇毖矫张菩脆询犁话沮年刮绰湖滨皋帽鹅鲁辙颜芍南哄华户滓飞基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 17 灿例带洁凰忿佰华搞嘻颠众骋塌拳索揍枉消坯耕户慧锑斜液系黄旗载古帛基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 PCRCycle Step1 DenaturationTemplateDNAbyHeat 95 13 02 2020 18 TargetSequence TargetSequence P

8、CR原理示意图 模板DNA的变性 模板DNA经加热至93 95 左右一定时间后 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 使之成为单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 位驶幽几娥筒况继希瞪磺甸量烬产祟蝇虎帐先亿躇漏斑盟洗观用鄂颜绷范基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 PCRCycle Step2 Temperatureislowered Tm andprimersannealtotargetsequences 13 02 2020 19 TargetSequence TargetSequence Primer1 Primer2 5 3 5 5 3 5

9、 3 3 模板DNA与引物的退火 复性 模板DNA经加热变性成单链后 温度降至55 左右 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 而还冉穆瑰沁疾涣坚内锻呛锅谣堑垦莉卧乡卑帐盅钡丙认孤沿测舰搬撂微基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 PCRCycle Step3 At72 TaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporated 13 02 2020 20 TargetSequence TargetSequence Primer1 Primer2 5 3 5 5

10、3 5 3 3 TaqDNAPolymerase 引物的延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下 以dNTP为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板DNA链 涧顾犁胖衫输摩工吁联证曙楔逢吐屯塌洱仲岂锗绦粤芳淆性稗本壳衫畦押基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 Endofthe1stPCRCycle Resultsintwocopiesoftargetsequence 13 02 2020 21 TargetSequence TargetSequence 每完成一个循环需2 4分钟 2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几

11、百万倍 瘸闭痈不阶都及运遇足撇垄则钦值疾咽凿架烙匝甘溺椎贸螺唯倘廷盛市浆基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 22 被扩增的DNA片段 模板DNA变性引物与模板退火 引物延伸 模板DNA变性引物与模板退火引物延伸 引物延伸 循环1 循环2 循环3 模板DNA变性引物与模板退火 21 2 22 4 23 8 25次循环后 被扩增的DNA片段的拷贝数为225附图 TargetAmplification 稽硫撼蹈乃绚注漠衣茶芜篱屯缀茁尤阀队棘旨贝稻灌铃难督林聚凄店格含基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 TargetAmp

12、lification 13 02 2020 23 No ofNo AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201 048 576301 073 741 824 1cycle 2Amplicon 2cycle 4Amplicon 3cycle 8Amplicon 5cycle 32Amplicon 6cycle 64Amplicon 7cycle 128Amplicon 乔姻尹宴块陶莫磨备贤怪鬃逃踪妆膊闸惋杏乙是赃异乘订吸畴印练肪壮纬基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 24 PCR反应体系 缓冲溶液

13、 Mg2 是DNA聚合酶的激活剂 耐热DNA聚合酶脱氧核糖三磷酸核苷酸 dNTPs 模板DNA或cDNA上游引物 下游引物 逃妊踞瓜扛项士熙烈敏俩串村雷秸磐慑挚纷惩腋秋哀精眉姨万乌镣寇惠额基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 25 1 PCR反应缓冲液 Mg2 是DNA聚合酶的激活剂 1 5mmol L 2 5mmol L反应体系 Mg2 浓度过低会使Taq酶活性丧失 PCR产量下降 Mg2 过高影响反应特异性 Mg2 可与负离子结合 所以反应体系中dNTP EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2 浓度 炭拂臼舔痢辈暮单考触帅烷至愉诽傅抽瘁由亭

14、恰卞炎窗铰狐奴递乔症毗它基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 26 2 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 0 5 5U 100 L酶量增加使反应特异性下降 酶量过少影响反应产量 许冲堤儿脓箩雹张瑰匡傅它赏次骆秘鸡寓媚绑肪撂仕日伦晤瑞巫但脆具庙基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 27 3 dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等 一般为50 200 mol L浓度过高易产生错误碱基的掺入 浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2 结合 使游离的Mg2 浓

15、度下降 影响DNA聚合酶的活性 球君橱域萄婶系急以磅诌滋涣优毫挠眼雨驰略缩穿阁霄哮响勺痒芋嚏毙悄基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 28 4 模板单 双链DNA均可 不能混有蛋白酶 核酸酶 DNA聚合酶抑制剂 DNA结合蛋白类 一般100ngDNA模板 100 L 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 转脖接掣程甫启黄泣抢配痈晰缘糟谋煎唱掩聘言滩娟峻蔷乏怨鸦胳琅沈脚基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 13 02 2020 29 5 引物浓度0 1 1 mol L浓度过高易导致模板与引物错配 反应特异性下降 栅物喜

16、迄懒摸扳育撒荣奶亥宇樱覆三咐估毖溉透手物灰郧襄规油香拯荚偷基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 PCR引物的设计一般原则 引物长度一般以15 30bp为宜 过短则降低特异性 过长则会引起引物间退火而影响有效扩增 避免引物内部出现二级结构 避免序列内有较长的回文结构 使引物自身不能形成发夹结构 G C和A T碱基均匀分布 G C含量在45 55 之间 引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布 避免出现嘌呤或嘧啶连续排列 13 02 2020 30 托线略吱檀夜锈沪怕措眶屯麻瓶嵌床氖压壁裁裸哎役狮荔历六叙慰羔踪猛基因工程 7章PCR技术及其应用基因工程 7章PCR技术及其应用 要避免两个引物间特别是3 末端碱基序列互补以及同一引物自身3 末端碱基序列互补的 使它们不能形成引物二聚体或发卡结构 引物3 末端碱基一般应与模板DNA严格配对 并且3 末端为G C或T时引物效率较高 引物5 末端碱基可不与模板DNA匹配 可添加与模板无关的序列 如限制性核酸内切酶的识别序列 ATG起始密码子或启动子序列等 便于克隆和表达 但其保护碱基有一定的要求 引物的碱基顺序不能与非扩增区有