《内毒素检查法在药品生产质控的应用修改》由会员分享，可在线阅读，更多相关《内毒素检查法在药品生产质控的应用修改（41页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、细菌内毒素检查在药 品生产质控上的应用 冯 聚 锦 湛江安度斯生物有限公司 一 鲎试验对药品生产质控的意义 药品生产企业实施GMP的意义在于使人们对药品 质量的控制从传统的成品检验 上升到对药品生 产全过程进行有效监控的现代质量管理模式 美 国食品及药物监督管理局 FDA 自2019年起大 力推行 过程分析技术 Process Analytical Technology PAT 更凸显了医药发达国家对药 品生产过程质控的高度重视 2 在医药工业的GMP条件下 热原就是内毒素 控 制内毒素就控制了热原 已成为共识 基于这种认识 许多国家的药典已由细菌内毒素检查项取代热原 检查项并且成为了发展的趋
2、势 将会有越来越多的 药典品种使用鲎试剂检查 不仅如此 鲎试验法在 医药工业上目前是注射药品生产质控的最好方法 它为众多的药品生产企业带来显著的经济效益 3 中国和美国是世界上应用鲎试剂最早的国家 也是 鲎试剂产量及用量最多的国家 尽管如此 两国在 鲎试剂应用的水平 程度及范围上仍有明显的差异 中国药典2010年版收载的BET品种有450多种 而USP收载的BET品种超过700种 70 30 生产质控 应用领域的比较 30 3 30 25 42 美国 70 5 90 中国 终产品检验 终点显色动态显色动态浊度凝胶法 方法学应用的比较 在医药发达国家 一个注射药品生产体系的建立或GMP认证 都
3、要求在生产质控上应用鲎试验方法 我国的GMP认证也有相关的 要求 如对制药用水的细菌内毒素监测 原料药的细菌内毒素监 测等 二 生产质控的基本特点及要求 1 按控制的时机分类 事前控制 对正在生产的产品质量控制有效 事后控制 对正在生产的产品质量控制无效 只对以 后生产的产品质量控制有效 2 按控制的方式分类 静态控制 对已完成的生产工序的质控无效 只对以 后的生产工序的质控有效 动态控制 对正在进行或将要进行的生产工序的质控 有效 3 生产质控对检验方法的要求 采样方便 微量 操作简单 快速 检查准确 灵敏 结果可靠 数据处理自动化 4 鲎试验法目前是满足药品生产质控的最 好方法 鲎试验的优
4、点 采样方便 微量 0 1 1ml 操作简便 快速 7 60分钟 灵敏 准确 最低可测0 001EU mL的内毒素含量 定量检测的范围可涵盖0 001 1 000EU mL 技术成熟 自动化程度高 鲎试验是目前能使药品生产的热原控制实现 动态监控和事前控制的唯一方法 三 药品生产过程内毒素的控制方法 1 内毒素监控体系 1 监控对象 重要的媒体及原料 水是制药工业最重要的媒体 是首要的监控对象 使用量大的原料 生产过程添加的各种辅剂 与中间体接触的各种用具 器皿及终产品的包装容器 各工序前后中间体内毒素水平的变化 至少在生产过程的重要工序之间要设置检测 点 例 如在除热原工序后设置检测点 检测
5、 该工序除热原 干烤 过滤 吸附 的效果 又如在分装工序前需抽检 确保中间体内 毒素水平不超出控制水平才进行分装 烘箱等除热原设备的验证 生产原料生产用具 容器入库清洗 除热原备用 工序1 原料 分装 辅剂 工序2 工序3 终成品入库 水 辅剂 1 2 3 6 8 4 5 7 9 10 鲎试验检查 1 2 3 内毒素检测点 工序运行路线 取样 检测结果反馈 2 药品生产过程细菌内毒素监控体系 2 建立内毒素监控体系的步骤 确定药品的内毒素限值L 分析药品生产过程 合理设置内毒素监测点 制定各监测点合理的内毒素控制水平Lx 进行干扰性验证试验确定各监测点样品的有效浓 度或有效稀释范围 选择所用鲎
6、试剂的灵敏度 进行日常的内毒素监测检查 3 内毒素控制限值的确定 如果终产品的内毒素限值为L 各监测点的内毒素控制水平为 LX 则LX L 某些原料或中间体在其后的生产工序中将要被稀释 计算其 稀释后的内毒素含量ED 如果ED 1 4L 可以允许该原料或 中间体的内毒素控制水平LX L 例如 某种主要原料在生产 时将要被稀释10倍使用 如果L为0 5EU ml 可以允许该原 料的内毒素控制水平LX 1 25EU ml 如果能确实保证在除热原工序后的中间体的内毒素 含量少于1 4L 可允许该工序前的LX适当大于L 在制定各监控点LX时 应注意热原具有积累性 制 药企业需要根据自身的生产条件及工艺
7、水平来制定 合理的LX值 在欧美通常以1 10L 1 4L作为LX 4 千万不要以药典的内毒素限值作为控制值 据了解 不少企业的质检人员以药典给出的该品种的内毒素限 值作为产品质量的控制值或者作为产品出厂放行的合格值 这种 做法其实不好 原因如下 1 药典给出的药品的内毒素限值是对药品质量的最低要求 任何有一定质量能力的企业都不应以这最低的要求作为自己产品 的标准 2 细菌内毒素检查是一项生物检查 有较宽的精确范围 特 别是凝胶法鲎试验 精确度只有 值的50 200 当产品的内毒 素含量值接近限值时 很容易出现结果的不确定性 3 理想的产品放行值应 1 4药典限值 5 各监控点样品的干扰验证
8、目的 找出每个监测点的供试品的无干扰浓度 抽取监测点的适量样品 选择凝胶法鲎试剂的灵敏度或定量鲎试剂的标准直线范围 计算检测样品的最大有效稀释倍数MVD 样品与鲎试剂相容性的初筛试验 样品与鲎试剂的干扰试验 干扰验证举例 凝胶法 某生物制品在冷冻干燥前的分装液 S 为 120mg ml Lx 0 05EU mg L 0 2Eu mg 1 Ls 0 05Eu mg 120mg ml 6 0Eu ml 2 若选用 0 125Eu ml的TAL 最大有效稀释 3 取分装液 S 用BET水作1 48倍稀释 得供试液 S48 4 取 0 125Eu ml的TAL对S48作干扰试验 5 如果干扰试验结果表
9、明S48对BET无干扰 就把这个 浓度定为S的日常监测浓度 即每批产品分装前 取 S稀释成S48 用 0 125EU mL的TAL作检查 如果 检查结果为阳性 表明S的内毒素含量超标 0 05Eu mg 不能进入分装冻干工序 如果检查 结果为阴性 S可进行分装冻干 6 生产过程细菌内毒素监控的常规检查 采样 把样品制备成供试液 如前S48 鲎试验检查 结果分析 将信息反馈至生产控制系统 四 细菌内毒素的快速检测方法 鲎试验在生产质控上应用的方法较灵活 不受药典法规的限制 既可采用药典法规接受的鲎试验方法 也可采用更新更先进的技术 和方法 以下介绍几种有代表性的最新的快速鲎试验方法 1 细菌内毒
10、素快速检测试剂盒 湛江安度斯公司的发明专利 属于凝胶法 原理 使用高灵敏度的试剂作低灵敏度使用 反应时间只需20 25分钟 操作方便 简单 用途 生产过程细菌内毒素的限量快速检测 特点 使用方便 快速检测盒内配置与国际使用接轨的单次试验鲎试剂 TAL 使用这种单次试验TAL时 直接加0 2ml样 品复溶试剂兼检测 不必象使用0 1ml 支TAL那样要 先加0 1ml的水复溶试剂 然后再加0 1ml样品检测 同一试剂盒有多个灵敏度供选择 在每一批号的快速检测试剂盒上都标示有至少两个可供选择的 灵敏度 使用时选择不同的灵敏度 0 对应有不同的反应时间 T0 如批号为0809082 的快速检测试剂盒
11、 灵敏度标示如下 0T0 0 25EU mL20 1分钟 0 125EU mL25 1分钟 CSE无需稀释 我们知道 作鲎试验最繁琐耗时的操作就是稀释标准内毒素 CSE 快速检测试剂盒配备了无需稀释一步到位的CSE 使实验真正快速方便 配套器具 得心应手 作快速鲎试验时 如果配合使用安度斯公司提供的可调移液 器 采样瓶 可定时的干式恒温仪等实验器具 可真正体会 到BET实验的快速 准确及方便 名称规格数量 鲎试剂 TAL 0 2ml 支 0 125EU ml 0 25EU ml 8支 工作标准内毒素 CSE 5EU 支1支 BET水 2ml 支1支 试剂盒组成 检查项目 反应管数 每管加样 阴
12、性对照 溶液D 20 2mL BET水 阳性对照 溶液C 2 0 2mLBET水 0 01mLE5 供试品阳性对照 溶液B 20 2mLS 0 01mLE5 供试品 溶液A 20 2mLS 使用方法 0 125EU mL 2 光度法定性快速检测法 属动态浊度或动态显色法 需要使用动态光度仪及相应软件 方法及步骤 1 确定供试品原液 S0 的内毒素限值 L或Lx 2 确定供试品无干扰浓度 如S8 3 制备不含可测内毒素的供试品S8 4 制备含L8浓度标准内毒素的阳性供试品S8L8 5 在日常监测时 以S8L8与TAL反应的时间T0作为 判断其它供试品内毒素含量的标准 凡是反应时间TL8 即 原液
13、S0的内毒素含量 L 凡是反应时间T T0的供试品 其内毒素含量 L8 即 原液S0的内毒素含量 L 只需供试品的动态曲线一达到预设光度值 即可知道 该供试品是否合格 甚至分析供试品动态曲线的走势 就可知道供试品是否合格 预设透光度值 S8L8 产品不合 格 产品合格 T1 T0 T2 S8 NC 100 95 Rt T 秒 3 光度法定量快速检测法 属动态浊度法或动态显色法 需要使用安度斯软件 生物探针 2019 方法及步骤 1 预先用标准内毒素与TAL反应制备一条标准曲线 存档 最理 想的标准曲线是用同体系模型法建立 参阅本公司讲义2019年3 月版 2 检测开始前调出存档标准曲线 3 反
14、应开始后 只要各供试品的动态曲线一达到预设光度值 界 面上的表格中立即显示出该供试品的内毒素含量 供试品内毒素含量 调用的标准曲线 注意事项 制备存档标准曲线的TAL必须与检测试剂相 同 供试品应在无干扰浓度且不超过MVD浓度内 检测 4 便携式检测系统 PTS PTS是美国查尔斯河实验室公司 Charles River Laboratories Inc 最新推出的生物分析系统 PTS是一种便携式 可现场使用 快速 定量的检 测系统 细菌内毒素的定量快速检测仅是PTS的功能之一 其它生物测定的功能正在陆续推出 PTS是由便携式光度仪和检测试剂卡两部分组成 技术原理 动态显色法鲎试验 每块试剂卡
15、中有四条反应通道如下 供试品 阳性对照 通道 2条 加样孔LAL显色底物CSE反应池抽吸孔 供试品 检查通道 2条 系统内置存档标准曲线 仪器自动测定吸光度 及进行数据处理 实验方法 开启仪器预热至37 插入试剂卡 在试剂卡的四个加样孔中各加入25 l 0 025ml 供试品溶液 按 检测 键 Enter 约7 15分钟后屏幕上显示如下检测结果 回收率 供试品含量 EU mL 变异系数 CV PTS的特点 使用极灵敏可靠的鲎试验技术 获得美国FDA认证 体积小巧 仅1公斤重 内置电源 可在任何现 场使用 7 15分钟可获得定量的检测结果 只需极简单的操作 插入检测卡片 加入样品 自动检测并显示
16、检测结果 无需用户建立标准曲线 无外部恒温孵育要求 检测范围 10 0 1EUmL 5 0 05 EU mL 1 0 01 EU mL 0 5 0 005 EU mL 可显示样品内毒素含量 回收率 变异系数 检测结果可贮存 打印或下载到电脑 PTS的应用 水制备系统的监控 研发产品的检测 生产现场半成品的快速检测 医疗器械的质量监控 如血液透析 目前PTS可分析的项目 细菌内毒素检测 7 15分钟 葡聚糖检测 10 30分钟 微量蛋白检测 20分钟 革兰氏阴性 阳性细菌及酵母菌 霉菌鉴别 3 7分钟 5 生产质控应用举例 下面的实例是国外某药厂对生产工艺用水连续25天的凝胶法 限量 和动态法 定量 的检测情况 该工艺用水的细菌内毒 素控制限值为0 125EU ml 在第十一日时凝胶法呈阳性 立即对 水系统进行处理 此后的第十二至二十五日均为阴性 动态法的 检测结果则揭示了内毒素的具体变化 在第八 九 十日内毒素 含量明显上升 第十日已经接近控制限值 按这一趋势 第十一 日很可能超过限值 事实也确实如此 了解这一信息就可以在出 现不合格产品前采取预防措施 EU mL 天 0 125EU
