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1、检验员基础知识培训 微生物 microorganism microbe 是一群个体 微小 结构简单的低等生物的统称 通常人的 肉眼看不见 必须借助于光学显微镜或电子显 微镜才能看到 概 念 微生物的分类 无细胞结构 无 产生能量的酶系 统 由单一核酸 和蛋白质衣壳组 成 必须在活细 胞内增殖 病毒 属于此类微生物 细胞核的分化程度高 有核膜 核仁和染 色体 能进行有丝分 裂 如真菌 藻类 细胞分化程度低 只有DNA盘绕而成的拟核 无核仁和核膜 包括细菌 衣原体 支原体 立 克次体 螺旋体和放线菌 微生物的主要特点 短 个体微小 0 1mm 需借助显微镜观察 平 构造简单 单细胞 简单多细胞或非
2、细胞 快 繁殖快速 20分钟一代 一天内1个 10亿 多 各类多样 细菌 真菌 病毒 原生动物 广 分布广泛 土壤 空气 水和极端环境中 细菌 细菌的群体形态 在固体培养基上 内 的群体形态 菌落 单个或少数的细胞在固体培养基上 内 会形成的以 母细胞为中心的一堆肉眼可见的 有一定形态 构造 特征的子细胞集合 细菌菌落常表现为湿润 粘稠 光滑 较透明 易挑 取 质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色 一致等 单位 CFU 任务一 微生物培养基 任务分析 n一 检测意义 培养基是供微生物 动植物组织生长和维持用 的人工配制的养料 要制作培养基 就需要了解 微生物的营养物质吸收方式以及常用的培
3、养基配 制技术 n二 检测方法 GB T4789 28 2003食品微生物学检验染色法 培养基和试剂 学习目标 n 知识目标 1 微生物生长所需要的基本营养及运输方式 2 培养基的概念 分类及配制原则 n 技能目标 1 正确进行培养基的分装和无菌检验 2 正确配制实验室常用培养基 相关知识 一 微生物的营养 1 微生物的细胞化学构成 微生物细胞 水 70 90 干物质 无机物 盐 有机物 蛋白质 多糖 脂 核酸 维生素 有机 酸等及其降解 产物 微生物的营养构成 微生物的营养物质按照在机体的生理作用不同可 分为 碳源 氮源 能源 无机盐 水和生长因子 微生物 动物 植物之间存在营养上的统一性
4、n 二 培养基的定义 培养基提供微生物生长繁殖和生物合成名种代谢产物 所需要的 按一定比例配制的多种营养物质的混合物 提 供微生物所需能量 包括碳源 氮源 无机元素 生长因 子及水 氧气等 n 三 培养基的分类 1 按成分分类 天然培养基 合成培养基 复合 半合成 培养基 2 按物理状态分类 半固体培养基 液体培养基 固体培养基 任务二 消毒与灭菌技术 任务分析 n 一 检测意义 在进行微生物检验前 可以通过消毒和灭菌技术 不 同程度的将实验物品和实验环境中的微生物减少甚至完全 杀灭 从而减少或消除外来微生物对试验结果的影响 生 物检测结果的真实性和准确性 n 二 检测方法 1 加热灭菌 干热
5、灭菌 湿热灭菌 2 辐射灭菌 紫外线灭菌 干热灭菌法 原理 干热灭菌是在电热干燥箱内利用高温干燥空气 160 170 进行灭菌 它是利用高温使微生物细胞内的蛋 白质凝固变性而达到灭菌目的 此法适用于玻璃器皿如移液管 试管和培养皿的灭菌 培养基 橡胶制品 塑料制品不能采 用干热灭菌 细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关 在菌体受 热时 当环境和细胞内含水量越大 则蛋白质凝固就越快 反 之含水量越小 凝固越慢 干热灭菌所需温度要高 时间长1 2h 但干热灭菌温度不 能超过180 否则 包器皿的报纸或棉塞就会烧焦 甚至引 起燃烧 干热灭菌法 n 1 将培养皿 吸管等下班器皿洗净干燥后 用旧 报纸
6、包好 或装入特制的铁筒中 n 2将包装好的玻璃仪器摆入烤箱中 彼此间留有一 定的空隙以便流通空气 n 3 关紧箱门 接上电源 n 4 设定温度 灭菌温度一般在160 170 保持1 2个小时 n 5 待自然降温冷却后才能开门取出玻璃器皿 避 免由于温度突然下降引起玻璃器皿碎裂 湿热灭菌法 高压蒸气灭菌法主要是指 将物品放在一个密闭的加压灭 菌锅内 通过加热 使灭菌锅 隔套间的水沸腾而产生蒸气 待水蒸气急剧地将锅内的冷空 气从排气阀中驱尽 然后关闭 排气阀 继续加热 此时由于 蒸气不能溢出 而增加了灭菌 锅内的压力 从而使沸点增高 得到高于100 的温度 导 致菌体蛋白质凝固变性而达到 灭菌的目
7、的 在同一温度下 湿 热的杀菌效力比干 热大 因为在湿热 情况下 菌体吸收 水分 使蛋白质易 于凝固 同时湿热 的穿透力强 可增 加灭菌效力 讨论 干热灭菌法和湿热灭菌法 哪个杀菌效力大 湿热灭菌法 一般培养基用0 1MPa 121 5 15 30min 可达到彻底灭菌的目的 灭菌的温度及维持时间 随灭菌物品的性质和容量等具体性况而有所改变 打开锅盖加水 放入待灭 菌的物品 密封 设定温度 时间 通电加热灭菌断电开盖 紫外线灭菌法 紫外线灭菌是用紫外灯进行的 波长为200 300nm的 紫外线都有杀菌能力 其中以260nm的杀菌能力最强 它 的杀菌效率与杀菌时间是成正比的 它的原理主要是抑制
8、了DNA的复制 另一方面 由于辐射能使空所中的氧电离 成 0 再使氧气生成臭氧或使水氧化生成过氧化氢 臭氧和过氧化氢均有杀菌的作用 紫外线的穿透力不大 所以只适用于无菌室的空气及物体及物体表面的灭菌 紫 外线灯距照射物不超过1 2m为宜 为了加强紫外线灭菌效果 在打开紫外灯前 可在无菌室内喷洒石 炭酸溶液 一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落 另一方面也可以 杀死一部分细菌 无菌室内的桌面 凳子可用2 3 的来苏乐擦洗 然 后再打开紫外灯照射0 5 1h 即可增强杀菌效果 达到灭菌目的 任务三 食品中菌落总数的检验 任务分析 n 一 检测意义 菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志 判定细菌
9、在食品中繁殖的动态 n 二 检测方法 GB 4789 2 2010 食品安全国家标准 食品微生物学检 验 菌落总数测定 菌落总数 指食品检样经过处理 在一定条件下培养后 所得1ml 或1g 被检样品中所含细胞菌落的总数 以CFU g ml 菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数 也不能 区分其中细菌的种类 只包括一群在计数平板琼脂中生长 发育 嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数 所以有 时被称为杂菌数 需氧菌数等 食品中细菌菌落总数越多 则食品含有致病菌的可能 性越大 食品质量越差 菌落总数越小 则食品含有致病 菌的可能性越小 须配合大肠菌群和致病菌的检验 才能 对食品做出较全面的评价 检 验
10、 程 序 检 样 25g mL 样品 225mL稀释液 均质 10倍系列稀释 选择2个 3个适宜稀释度样品匀液 各取1mL分别加入无菌培养皿内 每个培养皿中加入15 20mL 平板计数培养基 混匀 36 1 48h 2h 计算各平板菌落数 计算菌落总数 报告 n 培养基与试剂 平板计数琼脂培养基 无菌生理盐水 n 操作前 用镊子取酒精棉消毒桌子 消毒 手 n 从培养皿筒中取出培养皿 培 养 皿 筒 取出 培 养 皿 n 在培养皿上编号 提示 培养皿上的标记为稀释倍数 固体样品 半固体样品 稀释倍数为10 1 10 2 10 3 液体样品 稀释倍数为100 10 1 10 2 1 1 2 2 3
11、 3 空白空白 00 1 1 2 2 空白空白 固体 半固体样品称量 n 用镊子取酒精棉擦手 点燃酒精灯 n 取25g ml 样品加入225ml生理盐水中 对样品进行10 倍稀释 25g 225mL 生理盐水 10 1 1 1 2 2 3 3 空白 空白 10 2 10 3 灭菌生 理盐水 固体 半固体样品 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL n 在培养皿中加入平板计数琼脂培养基 15 20mL 轻 摇培养皿 使试样与培养基混匀 提示 倒培养基时 培 养皿的开口尽量要小 同时 开口对着酒精灯 提示 摇动培养皿时 切摇动培养皿时 切 勿使培养基溅到培养皿盖勿使培养基溅到培养皿盖 上 上 n
12、待培养基凝固后 将培养皿放入恒温培养箱 提示 培养皿放入培养箱时要倒置 n 注意选择设置为36 1 的培养箱 任务四 食品中大肠菌群的检验 任务分析 n 一 检测意义 大肠菌群是作为粪便污染的判定指标 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一 n 二 检测方法 GB 4789 3 2010 食品安全国家标准 食品微生物学检 验 菌落总数测定 n 大肠菌群系指一群在32 37 下24hr内 能发酵 乳糖产酸 产气 需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性 无芽孢杆菌 该菌群主要来源于人畜粪便 故以 此作为粪便污染指标 来评价食品卫生质量 具 有广泛的卫生学意义 大肠菌群的检测 第一法 大肠菌群MPN计数法 第
13、二法 大肠菌群平板计数法 第一法 大肠菌群MPN计数法 n 培养基与试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白胨 Lauryl Sulfate Tryptose LST 肉汤 煌绿乳糖胆盐 Brilliant Green Lactose Bile BGLB 肉汤 无菌生理盐水 无菌 1 mol L NaOH 无菌 1 mol L HCl 初发酵试验 每个样品 选择3个适宜的连续稀释度的样品 匀液 液体样品可以选择原液 每个稀释度接 种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨 LST 肉汤 每管 接种1mL 如接种量超过1 mL 则用双料LST肉汤 36 1 培养24 h 2 h 观察倒管内是否 有气泡产生 24 h 2 h产气
14、者进行复发酵试验 如未产气则继续培养至48 h 2 h 产气者进行复 发酵试验 未产气者为大肠菌群阴性 LST判定结果 n 大肠菌群的产气量 多者可以使发酵倒管全部充 满气体 少者可以产生比小米粒还小的气泡 如 果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时 可以 用手轻轻打动试管 复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物 1环 移种于煌绿乳糖胆盐肉汤 BGLB 管中 36 1 培养48 h 2 h 观察产气情况 产气者 计为大肠菌群阳性管 大肠菌群最可能数 MPN 的报告 确证的大肠菌群LST阳性管数 检索MPN表 见附录B 报告每g mL 样品中大肠菌群的MPN 值 第二法 大肠菌群平
15、板计数法 实验步骤及操作要点 1 样品的稀释 如第一法 2 平板计数 选取2个 3个适宜的连续稀释度 每个稀释度接种2 个无菌平皿 每皿1 mL 同时取1 mL生理盐水加入无菌平 皿作空白对照 3 及时将15 mL 20 mL冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼脂 VRBA 约倾注于每个平皿中 小心旋转平皿 将培养基 与样液充分混匀 待琼脂凝固后 再加3 mL 4 mLVRBA覆 盖平板表层 翻转平板 置于36 1 培养18 h 24 h 4 平板菌落数的选择 选取菌落数在15 CFU 150 CFU 之间的平板 分别计数 平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落 典型菌落为紫红色 菌落周围有红色的胆 盐
16、沉淀环 菌落直径 为0 5 mm 或更大 5 证实试验 从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型 和可疑菌落 分别移种于BGLB 肉汤管内 36 1 培养24 h 48 h 观察产气情况 凡 BGLB 肉汤管产气 即可报告为大肠菌群阳性 6 大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例 乘以4 中计数的平板菌落数 再乘以稀释倍数 即为每g mL 样品中大肠菌群数 例 10 4样品稀释液1 mL 在VRBA平板上有100个典 型和可疑菌落 挑取其中10个接种BGLB肉汤管 证实有6个阳性管 则该样品的大肠菌群数为 100 6 10 104 g mL 6 0 105CFU g mL
