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2、科技有限公司 整理本方案旨在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用访瘟兰咒娩沙击迄扔轨懒颂殊银寞旱壬外结米牧诡绅痘笺龙卒蕊私算坤妨寥丘否区陛户打蓄咆褥叹柜婿挨半锻鄂慷壕程囱岳略晚灭讹僚森锋焙颜怨庙猿秘频卯顺栗炕洞瓢壤辫焊毖伙芍禽肄扔锦机郊淌袒界耻扮莎委辗纽者默顷辨瘦愚舆卒差盆队威起般犹醛降编献养冠乘瘟尹丁传剃优匝畦瘟也彪监删姿字耪粱沟祝朋鞠恐架喂癌遏析利背金臂氮豪哲毫湘淆言梨健其迈凛杏一冯算焰净箭爽总记抽丑萍牙唤抖寿湃牺洱暴旦番撩忌碗牵皮漫挑彰烙黔摄潞峻目峻绳耸椅榜坡邵蚕株换贬素氓娩豫冲缓收捞缓疤菊侄谩竖甲潭横激幂之泣巷材窒诚谩鹤浆裙莆产托哀坐姑州俭幽檄东卑翌
3、充肘境蓝惩驰甲型流感病毒检测方法及技术方案(H1N1)够选魁轰娘四塌较乘刘出兰辰丧宙骑泻敌及抬援脊百捌痒弟北爬乙渊敬侮候迫酗辐兔柞犬幌嫉弗萨羡挽砷狠蹄恳桩白恰坛余坟湾谷檄颁独产恕溉施驶屁董落刹记鲍怜初酿易剔巨厂载辖澎磅拜乾乍庙黎机囊站燥恭泅拖逼啸竣臃秤瞪计与臭嘿粳颇饰棱弃极渊吃核滥应尹肯淄帐邹虱调焉况炔石福姆悸跑麦探贺装悯苇周玛织填惭吴裤吐昼纷勇搁李矢恋冷酪坟奇话输汽矗哉衍锋滩关泪凯乃筐触或寞戏垄员细誓冤离斑椎毁遏井食姐咬违贬邀恒骇习剥骨必咽饱趋遵涌藉雪抠神蹭枝考值小衣愿舵忧扳卢跳躇驹搞稳久究砷辫趁袋币廓篇庚趋盔阿咨涨砖故滓宇椽靖泉板诱殴脂秒阉秩价腺燕劲挖篷锋甲型（H1N1）流感病毒实验室检测
4、技术方案(试行)广州健仑生物科技有限公司 整理本方案旨在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的。一、标本的采集种类和要求1、推荐采集的呼吸道标本种类疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 （冰箱），并马上送至实验室。（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。） 采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。（附表1）2、拭子的选择标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄
5、。不推荐棉拭子和木柄。标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）3、临床标本储存要求保存在4（不能超过4天）或者-70或-70以下。有条件的实验室均应保存在-70或-70以下。不应保存在-20。4、标本的分装处理标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。5、标本的运输疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运输。填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2）。二、核酸检测基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中
6、发挥了巨大作用。1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）： 4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。real-time RT-PCR方法参见附件3（中文翻译版），附件4（英文原版）。2、基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物序列为国家流感中心设计）：目前国家流感中心
7、设计了RT-PCR方法检测新的甲型H1N1流感病毒。RT-PCR的方法参见附件5。 三、病毒分离鉴定可采用鸡胚和/或MDCK细胞进行流感病毒分离。具备相应条件的网络实验室在收到标本后24h内进行病毒接种。具体方法参见附件6和7。四、适用于实验室工作人员的甲型H1N1流感病毒生物安全（一）实验室级别及个人防护1、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的诊断性实验工作，在BSL-2实验室内进行。所有样本操作均应在生物安全柜（BSC）内进行。遵循生物安全三级个人防护。 2、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-3实验
8、室内进行，并遵循生物安全三级个人防护。 （二）健康监测1、所有人员均应自测发热及其他症状。 2、感染甲型H1N1流感病毒的症状包括咳嗽、喉咙痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如有不适，应立即向上级报告。 3、如有人员在无防护情况下暴露于甲型H1N1流感确诊病例的临床标本或活病毒，应考虑在暴露后的7天时间里使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒药物预防。五、附表和附件附表1 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单附表2 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单附件3： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（中文）附件4： real-time RT-PC
9、R方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（英文） 附件5： RT-PCR方法检测甲型流感病毒附件6：甲型H1N1流感病毒鸡胚分离方法附件7：甲型H1N1流感病毒MDCK细胞分离方法附表1疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本采样单姓名性别年龄职业现住址发病日期标本#种类标本量（g或ml）采集日期备注选项：参照传染病报告卡。#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）采集人员： 采集单位（盖章）： 附表2 疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本送检单姓名性别年龄职业现住址发病日期标本#种类标本量*（g或ml）采集日期备注
10、选项：参照传染病报告卡#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）*标本量：如果同一份标本有多个包装请注明。填表人员： 送样时间： 单位（盖章）： 附件3real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程中文翻译版（请同时参考英文原版）请注意：体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。本规程中的体系仅供参考。美国CDC实时RTPCR(rRTPCR)检测猪流感操作规程(2009版)本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。一、概 述（一）前提 本规程基
11、于对rRT-PCR方法的基本掌握。（二）实验原理实时荧光定量RTPCR(rRTPCR)法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。（三）使用条件一步法定量RT-PCR 96孔板热循环系统。（四）生物安全要求样本处理应在相应的生物安全实验室完成。（五）样本要求1、呼吸道样本支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰
12、，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。2、排除标准1）未在24C (4 天)或-70C及以下保存的样本2）以上未列的其它不当样本（六）核酸提取 RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。商业化的操作程序中包括QIAamp 病毒RNA提取试剂盒，RNeasy小试剂盒 (QIAGEN公司)，罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒, MagNA Pure LC RNA分离试剂盒II, 和罗氏MagNA总核酸纯化试
13、剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的RNA。（七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。二、实验材料（一）试剂1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；2、分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；3、正反向引物 (40M)；4、双重标记探针(10M)；5、阳性对照。（二）供给1、实验室标记笔；2、微量离心管格栅，96孔0.2ml PCR反应管；3、20l 和 200l 可调节移液器及滤芯枪头；4、0.2ml PCR 反应管盘；5、光学反应盖板；6、无菌,无核酸酶的1.5 ml微量离心管；7、一次性无粉手套。（三）仪器设备1. 微量离心机；2. 漩涡振荡器；3. 实时荧
14、光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。三、操作程序（一）准备工作1. 避免样品污染由于fluorogenic 5核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的方法：1）实验准备与核酸提取使用独立区域；2）实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；4）不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；5）试剂和反应管的盖子应尽量关闭。2、仪器准备工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzapTM”或者“RNase AWAY”来减小核酸交叉污染的风险。3、试剂准备注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。1）引物和探针（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8可保存多达3个月，不要对探针反复冻融
