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1、. . . .实验三 酵母醇脱氢酶的提纯及其性质的研究醇脱氢酶（ADH）是生物体内重要的氧化还原催化剂之一，在生物催化、生物医学领域都有较为广泛的应用。生物体内的很多醇类代谢都是通过醇脱氢酶催化完成的。醇脱氢酶来源广泛，种类繁多，可按肽链长度分为短链、中链、长链醇脱氢酶，所含肽链氨基酸残基数分别为250、375和600750，酵母醇脱氢酶（YADH）是其中研究和应用最为广泛的一种。酵母醇脱氢酶以NAD+/NADH为辅酶，可逆催化醇和醛/酮之间的氧化还原反应。酵母醇脱氢酶为四聚体，单个亚基肽链含347个氨基酸残基，亚基相对分子质量为35 000。（一）酵母醇脱氢酶的提纯一、实验目的1. 学习和掌
2、握醇脱氢酶提纯的原理和方法；2. 掌握醇脱氢酶活力的测定方法。二、实验原理以酵母为原料，利用热变性、有机溶剂沉淀蛋白质等方法，提取具有一定纯度的酵母醇脱氢酶。在提纯过程中，每经一步提纯处理，都需测定酶蛋白质含量和活力，并计算得比活力(本实验中比活力=活力单位数/mg蛋白质)。唯有比活力提高了，才证明所用提纯措施有效，酶制剂的纯度提高了。醇脱氢酶的辅酶NAD（以NAD为辅酶的醇脱氢酶，它只作用于一级醇、二级醇和半缩醛脱氢酶，动物醇脱氢酶还能催化环一级醇脱氢，酵母醇脱氢酶无此活力。另有以NADP为辅酶的醇脱氢酶，它只作用于一级醇。），它能催化乙醇脱氢变成乙醛，脱下的氢则使NAD+还原。CH3CH2
3、OH+NAD+CH3CHO+NADH+H+当有过量的醇存在时，NAD+ 被还原的速度与酶活力成正比，酶活力愈高，单位时间产生的NADH愈多。NADH对340nm紫外线有较强吸收，NAD+ 无此能力，因此可用测定A340nm的方法测得反应体系中NADH含量，从而得知酶活力的大小。0本实验用Folin-酚试剂法测定蛋白质含量三、实验材料、仪器和试剂1实验仪器：（1）干酵母粉：将鲜酵母分散成小块，放在搪瓷盘吹干。干燥后，研磨成粉末。（2）烧杯（3）吸管0.1ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml（4）容量瓶（5）试管（6）量筒（7）水浴锅（8）台天平（9）电子天平（10）离心机（5000r/min
4、）（11）722型分光光度计（12）UV-900型紫外可见分光光度计2实验试剂：（1）3mol/L 乙醇溶液：量取无水乙醇（比重：0.789，相对分子质量：46.07）174.6ml，加蒸馏水稀释至1000ml。（2）0.06mol/L 焦磷酸钠溶液（pH8.5）：称取焦磷酸钠（Na4P2O210 H2O）22.56g，溶于蒸馏水，稀释至1000ml。（3）0.0015mol/L NAD溶液：称取NAD 0.0995g（NAD相对分子质量：663.44）溶于蒸馏水，稀释至1000ml。（4）0.01mol/L 磷酸氢二钾溶液：溶1.74g K2HPO4于蒸馏水并稀释至1000ml。（5） 丙酮
5、（A.R.）（6） 0.066mol/L 磷酸氢二钠溶液：溶9.37g Na2HPO4于蒸馏水并稀释至1000ml。四、实验操作步骤 1酵母醇脱氢酶的提纯（1）粗提置20g干酵母于250ml烧杯中，加0.066mol/L Na2HPO4溶液80ml，37水浴锅保温2h，不断搅拌、再于室温提取3h，离心20min（4000r/min）取上清液3ml，测定蛋白质含量及酶活力，其余上清液量得体积后，倾于150ml烧杯中。（2） 热变性沉淀杂蛋白将上清液55保温1520min，不断慢速搅拌。保温毕，立即置冷水中冷却，离心20min（4，4000r/min）。吸取上清液3ml，测蛋白质含量及酶活力。其余
6、上清液量得体积后，倾于烧杯中。（3） 有机溶剂沉淀杂蛋白将上清液置盐冰浴中降温至-2以下，按100ml上清液加50ml丙酮的比例加入预先冷至-2以下的丙酮，边加边搅。加毕，放置片刻，低温离心20min（0，4000r/min）。吸取上清液3ml，测蛋白质含量及酶活力。其余上清液量得体积后，倾入已置于盐冰浴的烧杯中。（4） 有机溶剂沉淀酶蛋白按100ml上清液加55ml丙酮的比例，逐滴加入冰冷的丙酮，使溶液保持-2以下。待沉淀完全后，低温离心15min（0，4000r/min）。弃去上清液，沉淀溶于少量蒸馏水，转移至透析袋内，对冷水透析3h（在冰箱中进行）。离心除去沉淀，上清液即为达到一定纯度的
7、醇脱氢酶制剂。2.蛋白质浓度的测定吸取1、2、3步骤所取的样液及最后制得的酶制剂0.5ml，用蒸馏水稀释100200倍。按考马斯亮蓝法或紫外吸收法测定蛋白质含量。3.酶活力测定样液及酶制剂均需用0.01mol/L K2HPO4溶液稀释，稀释倍数如下：V1（粗提取液）：V（Na2HPO4）=1：4（或1：9）V2（热变性去杂蛋白样液）：V（Na2HPO4）=1：9（或1：19）V3（有机溶剂去杂蛋白样液）：V（Na2HPO4）=1：9（或1：19）V（酶制剂）：V（Na2HPO4）=1：9（或1：19）吸取0.06mol/L 焦磷酸钠溶液0.5ml、3mol/L乙醇溶液0.1ml、0.0015m
8、ol/L NAD溶液0.1ml、蒸馏水2.2ml置于石英比色杯中（容量4ml），加入已稀释的样液或酶制剂0.1ml，立即混匀，测定A340nm，以后每隔15s测1次，直至A340nm不变，记下反应时间和A340nm读数。于另一石英杯中，以蒸馏水代替底物，作空白试验。每分钟A340nm增加0.001为1活力单位。表17 测酶活力加样表（ml）比色杯焦磷酸钠乙醇NAD蒸馏水稀释后酶液空白杯0.500.12.30.1测试杯0.50.10.12.20.1表18 实验结果记录分析表提取步骤总体积/mlA蛋白质浓度/(mg/ml)B蛋白质总量/mgC酶活力/UD总活力/UE比活力/(Umg-1)F回收率（
9、%）蛋白质G酶活力H1粗提1002热变性去除杂蛋白3有机溶剂去除杂蛋白4有机溶剂沉淀杂蛋白注：C=AB，E=AD，F=D/B回收率=（每次总活力/第一次总活力）100% 纯化倍数=每次比活力/第一次比活力4.结果将测得数据或计算结果填入上表。提纯酶时，常用此表，它反映了所采用的每一提纯步骤的效果。（二）酵母醇脱氢酶的专一性一、实验目的 了解酵母醇脱氢酶的专一性二、实验原理用不同的醇（乙醇、正丙醇、甲醇）作底物，观察醇脱氢酶的专一性。RCH2OH+NAD+RCHO+NADH+H+根据NADH对340nm波长紫外线有最大吸收的特性，可用A340表示酶活力。每毫克酶蛋白有多少酶活力单位称为比活力。醇
10、脱氢酶对于各种不同的醇应有不同的比活力。三、实验材料、仪器和试剂1实验仪器：（1）吸管0.1ml、0.5ml、1ml（2）试管（3）722型分光光度计（4）UV-900型紫外可见分光光度计2实验试剂：（1）3mol/L 甲醇溶液：120ml无水甲醇（比重：0.786，相对分子质量：32）加蒸馏水稀释至1000ml（2）3mol/L 乙醇溶液：174.6ml无水乙醇（比重：0.789，相对分子质量：46.07）加蒸馏水稀释至1000ml（3）3mol/L 正丙醇溶液：225ml正丙醇（比重：0.804，相对分子质量：60.0）加蒸馏水稀释至1000ml（4）0.01mol/L磷酸氢二钾溶液：溶解
11、1.74gK2HPO4于蒸馏水并稀释至1000ml（5）0.06mol/L焦磷酸钠溶液（pH8.5）：称取焦磷酸钠（Na4P2O210H2O）22.56g，溶于蒸馏水，稀释至1000ml（6）0.0015mol/L NAD溶液：称取NAD0.0995g（NAD相对分子质量：663.44）溶于蒸馏水并稀释至1000ml（7） 酵母醇脱氢酶液：将酵母醇脱氢酶的提纯实验制得的酶制剂，用0.01mol/L磷酸氢二钾溶液稀释至每毫升含2001000活力单位。（8） Folin-酚试剂四、实验操作步骤1. 将4只石英比色杯（光径1cm）编以0、1、2、3号，按下表加入试剂。先向0号比色杯加入0.1ml稀释
12、酶液，混匀，放入分光光度计，用以调零。再向1号比色杯，加入0.1ml酶液（开始计时），迅速混匀测A340nm，以后每隔15s测一次A340nm，直至A340nm值不再上升。管号试剂01230.06mol/LNa4P2O2溶液（pH8.5）0.50.50.50.50.0015mol/L NAD溶液0.10.10.10.13mol/L 甲醇溶液0.13mol/L 乙醇溶液0.13mol/L 正丙醇溶液0.1H2O2.32.22.22.2表19 酵母醇脱氢酶的专一性测定加样表按同法再测2、3号比色杯内的溶液。以A340nm为纵坐标，时间（s）为横坐标作图。取初速度（曲线上升部分）求得酶活力。本实验以
13、A340nm每改变0.001单位定义为一个活力单位，以酶活力单位/分表示酶活力。2取酶液0.1ml，加蒸馏水4.9ml，摇匀。按（三）紫外吸收法测定蛋白质含量。（以蒸馏水代替酶液作空白试验，以此调零）。对照标准曲线，求得蛋白质浓度。计算得酵母醇脱氢酶对三种醇的比活力（比活力=活力单位数/mg蛋白质）。以比活力为纵坐标，醇的碳链长度为横坐标作图，按图说明酶的专一性。（三）紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键
14、含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速、不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。 此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。 下面介绍四种紫外吸收法： 1. 280nm的光吸收法： 因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值
