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1、下载可编辑基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法）一、 基因克隆 事前三问a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？b.这个基因在哪种材料中扩增？c.材料需要怎么处理？ 实验前准备工作 a.设计引物，准备材料，b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂盒c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准备 基本流程 提取和纯化RNAcDNA第一条链合成PCR凝胶电泳胶回收连接转化涂平板挑单菌落摇菌提质粒测序1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内
2、含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1） 实验前准备预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制 75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。2) Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下：（1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，移入管内，用力摇15 s，在15-30温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分
3、离。（2）4，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。（3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，1530 温育23 min。（4）在12000g，4离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。（5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。（6）在12000g，4离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。（7）用1 ml的75%乙醇
4、洗RNA，涡旋振荡样品，在7500g，4离心5 min，弃上清。（8） 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100l用枪头吸几次，5560温育10 min使RNA溶解。（9）配制以下体系：10DNase buffer 5 lDNase I （RNase-free）（40 g/l） 1 lRNasin Inhibitor（40 g/l） 1 lTotal RNA 70 g加去RNase水至总体积为50 l（10）37 水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 l，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 l的3 mol/L NaAC溶液，200 l
5、的无水乙醇，-80 沉淀30 min。（12）28 ，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50l无RNase的水溶解RNA。3） RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测 取2ul RNA 与1 ul 10Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。（2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质量。4） cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA：1） 在Eppendorf管中配制下列混合液：试剂名称 使用量模
6、板RNA 1 gOligo dT primer (50 M) 1 ldNTP Mixture(10 mM) 1 lRNase free dH2O up to 10 l2） 65 保温15 min 后迅速在冰上急冷2 min。3） 离心数秒使模板RNA/引物等的混合液聚集Eppendorf管底部。4） 在上述Eppendorf管中配制下列反转录反应液:试剂名称 使用量上述模板RNA/引物等的混合液 10 l5Frist-Stand Buffer 4 lRNase Inhibitor(40 U/ l) 0.5 lMTV RTase (10 U/l) 0.5 lRNase free dH2O up
7、to 20 l5） 37 保温60 min。6） 95 ,5 min后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。1.2小麦胚及胚乳总RNA的提取（1）配制RNA抽提buffer，50 ml中含有：1M Tris-HCl（PH 9.0） 2.5 ml4MNaCl 1.5 ml10%SDS 5 mlDEPC-H2O 41.25 ml（2）取以上RNA提取液650 ul，加350 ul水饱和酚，放入1.5 ml离心管中，65 水浴预热。（3）研磨0.3 g材料，直至呈粉末状，待液氮刚刚挥发，迅速加入到上述预热的提取液中，立即剧烈震荡，约10 min。（4）再加入400ul氯仿，抽提10 min，1
8、2000rpm 4 离心10 min。（5）取上清，加入等体积的氯仿，混匀摇10 min，12000rpm 4离心10 min。（6）取上清，加1/3体积的8 M氯化锂，4 保存过夜。（7）离心10 min，弃上清液，留沉淀，用75%乙醇洗1次，再用无水乙醇洗5-10 s，晾干，溶于80 ul DEPC水中。（8）加入9 ul DNA酶(无RNA酶)，10 ul 10buffer（DNA酶所带）和1 ulRasin（Rnas抑制剂），37 30分钟（再加500 ul水）（9）取出用 300 ul氯仿和 300 ul苯酚抽提，摇10 min钟，静止10 min，12000 rpm 4 离心10
9、min。（10）取上清，加入等体积的氯仿，摇10 min，静止10 min，4 离心10 min。（11）取上清，加1/10 NaAC（3M，PH 5.2），再加2倍体积的预冷无水乙醇， -80 冰箱过夜；（10）12000rpm离心15 min，弃上清液，留沉淀，晾干，溶于40 ul DEPC水中，电泳检测其完整性，保存于-80，备用。 2.2.2.1 cDNA第一条链的合成（1） 基因组DNA的去除反应试剂 使用量5xgDNA Eraser Buffer 2.0 ulgDNA Eraser 1.0 ul Total RNA 5 ulRNase Free dH2O up to 10.0 ul
10、 42 2 min 4 10 min(2) 反转录反应试剂 使用量5xPrimeScriptBuffer 2(for Real Time) 4.0 ulPrimeScriptRT Enzyme MixI 1.0 ulRT Prime Mix 1.0 ul的反应液 10.0 ulRNase Free dH2O up to 20.0 ul 37 15 min 85 5 sec 4 10 min -20 保存备用2.基因cDNA克隆2.1基因片段的PCR扩增 以反转录后的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为20ul：10PCR Buffer 2.0 ul，2.5 mM dNTPs 1.6
11、ul，10 mM上下游引物各0.8 ul，Taq 酶0.3 ul，模板cDNA1.0 ul，ddH2O补足至20 ul。按照下列条件进行PCR扩增： 94 4 min 94 30 sec 50 40 sec 30 cycles 72 1 min 72 10 min 2.2 PCR扩增产物的检测和回收纯化PCR扩增产物在1% 琼脂糖凝胶(含有 0.5 ug/ml溴化乙锭)上进行电泳，在紫外灯照射下进行观察，与标准分子量进行比较估测扩增DNA片段的大小，若与预计的大小相符，则使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将扩增出的片段回收，主要操作步骤如下：1) 在紫外灯下切下将要回收的条带(尽量使用长波长的UV
12、)，称重。2) 按每 100 mg 琼脂糖胶加入300 ul溶胶液PN，置于50 水浴中 10 min，每隔2 min混匀一次，使胶彻底融化，室温放置2 min。3) 将UNIQ-10柱放入2 ml的收集管中，加入600 ul平衡液BL，13000rpm，离心30 sec。3) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的平衡液，将融化的胶溶液转移到UNIQ-10柱中，静止2-3 min，13000rpm，离心30 sec。4) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，再放回收集管中，加入700 ul漂洗液PW(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，13000rpm离心30 sec。5) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，放回收集管中，加入 500 ul漂洗液PW，13000 rpm离心30 sec，重复一次。6) 取下UNIQ-10柱，倒掉废液，放回收集管中,13000rpm，离心2 min。7) 将UNIQ-10柱放入一新的1.5 mlEp管中，在柱子的吸附膜中央悬空滴加50 ul预热70洗脱液EB，室温放置5 min。8) 12000 rpm，离心l min，Ep管中液体即为回收的DNA片段，-20保存备用。2.3 回收产物与PMD-T载体的连接与转化 采用TAKARA公司的PMD-T载体进行连接反应，感受态细胞DH5a作为转化细胞进行转
