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1、上海交通大学医学院课题设计任务书 课题名称 灵活开始的卵巢超排卵方案 的可行性研究 指导教师 匡 延 平 研究生姓名 秦宁馨 起止年限 2014.12-2016.3 目的意义和国内外概况：(一） 目的意义：1、 提出基于高孕激素状态下灵活开始的促排卵方案(flexible started oviary stimulation, FSOS)，通过分析胚胎学结果及妊娠结局，证明其可行性；2、 描述FSOS的内分泌特征，通过特征分析FSOS可能的作用机制；3、 分析可能对FSOS促排卵过程和结果产生影响的因素；4、 探索FSOS作用特点，初步探究卵泡募集、选择、凋亡的可能机制。(二） 国内外概况：体
2、外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET）自1978年全世界首例试管婴儿Louis Brown出生后，人们开始不断地探寻更有效的方案以在IVF-ET中获得足够数量和质量的胚胎。早期的获卵多通过自然周期，在排卵前频繁监测卵泡大小及性激素水平，可控性差；同时自然周期单卵泡发育，治疗效果低，因此导致早期的试管婴儿效率低下。从20世纪70年代开始，控制性超促排卵(conlrolled ovarian stimulation，COS)成为了IVF-ET技术中重要的组成部分。20世纪80年代中期，随着GnRH类似物（gonado
3、tropin releasing hormone agonist, GnRH-a，如达菲林、达必佳等）的问世，基于垂体降调节的COS应运而生，如超长方案、长方案、短方案、拮抗剂方案等，目前仍然是辅助生殖领域最常用的促排卵方案。从前次月经周期的黄体中期或本次月经周期的早卵泡期开始，GnRH-a通过长期占据垂体细胞表面GnRH受体，使GnRH受体脱敏，实现垂体水平降调节1。降调节方案和GnRH拮抗剂方案作用机制相似，都是通过抑制垂体GnRH受体达到控制早发LH峰的目的，两者作用位点相同。垂体降调技术能够有效的抑制COS过程中自发性LH峰的产生，具有易控制、妊娠率满意等优点。但同时具有注射时间长、药
4、物费用高、卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS）发生率高、高雌激素状态新鲜胚胎移植子代安全性隐患2等缺点，且卵子在垂体被抑制的前提下获得，卵子利用率其实并不高。卵巢轻微刺激（mild ovarian stimulation, MOS）在克罗米芬（clomiphene citrate, CC）应用到IVF后，逐渐改变了临床医生“更多获卵”的促排卵观点，近年来芳香化酶抑制剂来曲唑（letrozol, LE）在早卵泡期的联合使用又推进了MOS的临床应用3、4。MOS从月经期第3-5天开始，旨在更低廉的费用、更温和安全的卵巢刺激、更优质的卵
5、子和胚胎，采用非垂体降调节的方式，在更符合生理内分泌的情况下获得卵子，卵子利用率高、胚胎着床率高。但同时反对者认为MOS使卵巢低反应（poor responder， PR）的发生率增加，不能广泛应用。MOS另一个弊端是容易提早排卵，在垂体非降调节的前提下，由雌激素（Estradio， E2）升高诱发黄体生成素（luteinizing hormone, LH）峰提早出现，造成卵泡提早排卵、过早黄素化及卵细胞质量受损，周期取消率增加，患者经济和精神上增加了一定负担。 偶然的机会让人们认识到黄体期促排卵（luteal phase stimulation, LFS）的可行性5、6。随着冷冻技术的成熟，
6、玻璃化冷冻技术下胚胎解冻存活率可以达到98%以上，其安全性也得到证实7。基于全胚冷冻的策略下，在排卵或取卵后1-3天内开始促排，使用来曲唑或克罗米芬（clomiphene citrate, CC）联合Gn，在黄体期可获得优质的卵子，促排卵过程无自发LH峰、 OHSS风险低，卵子利用率高，胚胎种植率满意，且子代安全性可靠8。本中心首创取卵后开始的促排，即二次刺激（double-stimulation），被国际同行评价为“上海方案（Shanghai Protocal）”9。黄体期促排为卵巢低反应（poor responder，PR）等患者增加了新的获卵机会，同时为COS提供了一种全新的促排卵思路。
7、黄体期促排的可行逐渐引人思考，是什么导致了黄体期促排无自发LH峰呢？是和黄体分泌的孕激素相关？还是黄体期雌孕激素联合的作用？带着探索和疑问，同样在全胚冷冻的条件下，本中心从2013年12月开始于早卵泡期使用Gn联合孕激素促排，其中孕激素包括安宫黄体酮（即醋酸甲羟孕酮，medroxy- progesterone acetate， MPA）和达芙通，证实了高孕激素状态下卵巢促排卵（Progestin-Primed Ovarian Stimulation，PPOS）的可行性。PPOS证实了早卵泡期应用孕激素可阻断雌激素引起的LH峰，有效控制了提早排卵。而且孕激素阻断LH峰的靶点在下丘脑孕激素受体，由
8、于孕激素在雌激素较高水平的情况下可以可以协同雌激素诱发LH峰10，使颗粒细胞过早黄素化，因此PPOS促排卵不产生LH峰的关键是孕激素的早期使用。在目前多种促排卵方案并行，各具利弊的情况下，随着患者就诊需求多样性的增加，一个新的问题出现了COS究竟应该从何时开始？传统的降调节方案、轻微刺激、黄体期促排、高孕激素状态促排启动时间相对严格，或是月经期3-5天，或是排卵后1-3天，或是黄体中期，促排卵过程历时几天至几个月不等。但在临床治疗过程中，有许多患者因月经期无法复诊而推迟几天到了中卵泡期或晚卵泡期就诊，或者在月经期已经产生了优势卵泡（dominant follicle），临床治疗过程中，遇到这种
9、情况，通常情况下只能取消周期，或待优势卵泡排卵或黄素化以后进行黄体期促排，但黄促开始时间需在排卵后1-3天内、小卵泡8mm左右若干，促排卵条件又有限制且距离促排卵启动时限较长，虽然周期未取消，但一定程度上增加了患者经济和心理负担，患者接受度和临床普适性不高。因此这些患者尽管窦卵泡计数（antral follicle count, AFC）有时并不少，但通常情况下本周期只能取消。众所周知，从始基卵泡至形成窦前卵泡需要9个月以上时间，从窦前卵泡到成熟卵泡需要85天。在窦卵泡发育后期，血清卵泡刺激素（foliclle stimulating hormone, FSH）水平及生物活性增高，超过一定阈值
10、后，卵泡内有一组窦卵泡进入“生长发育轨道”，这种现象称为募集。募集分为两个过程，第一阶段前颗粒细胞由扁平状向立方体状转变，颗粒细胞数量增多，第二阶段卵母细胞体积增大，颗粒细胞继续增多。这些从静止的卵泡池中募集出来的窦卵泡，面临着形成优势卵泡排卵或闭锁的选择。在上周期黄体退化5-7天之后，被募集的发育卵泡群中，FSH阈值最低的一个卵泡，优先发育为优势卵泡，其他卵泡逐渐退化闭锁。传统观点认为卵泡的募集仅发生于上一月经周期的黄体期，这些募集的窦卵泡有一个被选择为优势卵泡而其他的窦卵泡逐渐闭锁。但近年来更多的证据人们逐渐认识到在两次排卵之间，窦卵泡呈一次次募集波出现，且本次月经周期募集的卵泡未必当月闭
11、锁11。这些成群出现募集波，是灵活开始促排卵的基础。在卵泡被募集后的早卵泡期，卵泡膜上表达LH受体，LH作用于卵泡膜细胞，刺激其产生雄激素，依据两细胞-两性腺激素学说，颗粒细胞合成雌激素。随着卵泡增大和雌激素合成增多，卵泡膜细胞LH受体增加，同时颗粒细胞逐渐表达LH受体，因而中晚卵泡期成熟颗粒细胞可对LH直接产生应答。同时增加的雌激素通过对下丘脑垂体轴的负反馈抑制FSH的分泌，血清中FSH逐渐下降，不足以维持其他高FSH阈值卵泡的发育，导致这些卵泡逐渐走向闭锁12、13。被选择的优势卵泡完成继续生长，卵泡直径增大，颗粒细胞增多，卵泡液增多，直至卵泡成熟破裂并排卵，完成优势化。这些传统方案之所以
12、无法做到灵活开始，是因为随着优势卵泡的出现，卵巢内卵泡发育不均衡，体现在卵泡大小不一、卵泡膜细胞LH受体表达量不等、颗粒细胞LH受体表达量不等，这就意味着在外源性Gn直接刺激卵巢的情况下，各卵泡对Gn的敏感性不同，当优势卵泡颗粒细胞对LH产生反应，加速卵泡生长、黄素化的时候，而小卵泡主要对FSH敏感还在继续增大体积，大小卵泡生长差异较大，这将可能导致提早LH峰的出现、卵泡过早黄素化和卵子质量受损等。传统方案在这种情况下直接促排卵无法实现高获卵率、高卵子利用率，因而一直无法做到灵活开始。既往报道中，在癌症患者中也有随机开始的卵巢促排卵（Random-started Ovary Stimulati
13、o， ROS）14、15,针对这些诊断癌症患者，因为需要保存生育力，同时节省时间避免延误癌症治疗，在早卵泡期、晚卵泡期和黄体期开始，Gn促排卵或Gn联合LE促排卵，这种方案也具有可行性，在促排卵末期适当使用GnRH拮抗剂（GnRH- antagonist，GnRH-ant），这种促排卵开始时间相对随机，可获得和常规拮抗剂方案无差异的胚胎学结果。但实施这些方案的患者总数并不多，目前仍然没有大量应用。而且拮抗剂方案对卵巢低储备的患者而言，抑制早发LH峰的效果并不佳，卵子利用率并不高，因此这种方案仍然不具普适性，目前无法大规模临床应用，仍然存在许多弊端。那么如何克服拮抗剂的种种缺点又同时突破传统方案
14、的限制呢？既往黄体期促排和高孕激素状态下促排卵的可行性证明，内源性孕激素和外源性孕激素在促排卵过程中对卵子和胚胎质量均未产生影响，那么如果在产生优势卵泡以后且排卵以前使用GnRH-a产生短暂的flare-up效应，是否可以使已经在颗粒细胞上表达的LH受体对一过性LH升高产生反应，优势卵泡的颗粒细胞黄素化，而抑制后续促排卵过程中这些LH受体对LH的反应、不影响小卵泡的促排卵呢？基于这个假设，本中心尝试使用灵活开始的卵巢促排卵方案。即在卵巢产生优势卵泡（卵泡直径10-18mm）且在排卵前，使用GnRH-a进行trigger，次日开始使用孕激素（MPA或达芙通）和克罗米芬联合Gn进行卵巢促排卵，当1
15、个优势卵泡直径大于20mm或3个以上卵泡直径大于18mm时使用GnRH和人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）进行诱发，36到38小时后进行采卵术（oocyte retrieval, OR），IVF或ICSI授精后优质胚胎进行冷冻，进行后续胚胎移植。这是一种全新的促排卵方案，它的作用机制不同于常规PPOS和LPS，更不同于垂体降调节方案，有独特的作用特点。基于临床患者就诊需求的多样性，产生了灵活开始的卵巢促排卵方案，那么这种方案的是否具有可行性呢？本研究将针对这一问题进行验证和研究探讨。首先，将FSOS与PPOS、LPS进行对比，观察FSOS能否
16、获得与常规促排卵方案相同效果的胚胎学结果；其次，对FSOS促排卵过程中的内分泌特征进行描述，并通过和PPOS、LPS比较差异，探讨FSOS可能的作用机制；再次，不同条件下进行FSOS的促排卵效果必然不同，那么可能对结果产生影响的因素有那些同样值得探讨；最后，FSOS这种全新的促排卵策略必将给人们带来更多关于卵泡募集、选择和优势化的思考，激发对卵泡发育机制的探索，从而更好地将理论应用到临床，从而更好地指导临床质治疗，达到更简单、安全、有效的IVF目的。主要研究、试验内容、实验设计和技术关键：（一） 主要研究、试验内容1. 描述FSOS促排卵过程中的内分泌变化特征；2. 分析不同FSOS内分泌变化特征产生的不同促排卵效果；3. 比较FS
