《粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究(精)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功能的初步研究(精)（56页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 导师 钟 江 教授 研究生 王立娟 992305 研究方向 分子病毒学 生命科学学院 微生物学专业 2002年6月10日 复旦大学硕士学位论文 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 2 主要内容和时间安排 l选题背景 l实验材料和方法 l实验结果与分析 l总结与展望 预计时间 30分钟 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 3 杆状病毒概述 l杆状病毒 双链DNA病毒 有囊膜 感染昆虫 l分类 核型多角体病毒属 NPV 颗粒体病毒属 GV l形态与结构 两种表型 包涵体来源型病毒 ODV 出芽型病毒 BV
2、 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 4 杆状病毒粒子的两种表型 BVBVODVODV 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 5 杆状病毒双相生活史 l第一时相 时间 感染后的0 24小时 结果 产生大量的BV 出芽释放 在虫体内传播 l第二时相 时间 感染24小时以后 结果 形成大量的ODV 被多角体蛋白包裹 最终 形成多角体 经口感染其它宿主 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 6 杆状病毒多角体 l电镜中看到的野生型AcMNPV的多角体 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 7 多角体的形成 l病毒感染的
3、极晚期表达多角体蛋白 l多角体蛋白占细胞中总蛋白的50 l依靠核定位信号序列运送到细胞核 l多角体蛋白包裹ODV 形成多角体 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 8 干扰多角体形成的因素 l多角体蛋白基因 AcMNPV多角体蛋白的3个Trp被Lys34 His36 和Phe37替代 多角体能够结晶 但形态差 异大 病毒粒子的包埋受影响 AcMNPV多角体蛋白第25位的Asp变为Gly 仅产生一个不正常的大立方形的多角体 不 包埋病毒粒子 l25K基因 该基因突变后多角体数量减少 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 9 多角体的生物学功能作用 l保护病
4、毒粒子 l感染昆虫所必需 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 10 选题背景 杆状病毒的应用 l杆状病毒的应用 a 杆状病毒表达载体系统 b 杆状病毒生物杀虫剂 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 11 杆状病毒表达载体系统的优点 l可以容纳大的插入片段 约10kbp l高效表达 l产物有毒性也可表达 l有外源DNA插入座位 l可以同时表达多个外源蛋白 l可转译后加工修饰 l可在细胞系内表达 也可在昆虫活体内表达 l安全性好 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 12 选题背景 杆状病毒的应用 l杆状病毒的应用 a 杆状病毒表达载
5、体系统 b 杆状病毒生物杀虫剂 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 13 杆状病毒生物杀虫剂 l优点 安全有效 不污染环境 有后效 l缺点 杀虫速度慢 杀虫谱狭窄 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 14 杆状病毒生物杀虫剂 l构建重组杆状病毒杀虫剂的策略 a 表达昆虫激素 b 表达昆虫特异性毒素 c 删除内源性杆状病毒基因 d 应用增强蛋白来增强病毒的毒力 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 15 增强蛋白 Enhancin lEn Tn编码901个氨基酸 分子量为104ku l是一种金属蛋白酶 都具有金属蛋白酶的金属离子结合
6、基序 HE L I GH 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 16 增强蛋白 Enhancin l在Genebank中运行Blast检索工具得到19 条明显具有同源性的序列 去掉重复和非 全长序列 共有13种不同的类似于增强蛋 白的蛋白 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 17 杆状病毒增强蛋白间的进化关系 Clustal法 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 18 增强蛋白的增效机理 l昆虫的围食膜 l增强蛋白作用机理 降解围食膜蛋白 粘蛋白IIM 提高围食膜的通透性 杆状病毒更容易进入昆虫体内 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构
7、与功 能的初步研究 王立娟 19 利用增强蛋白提高AcMNPV感染力 l问题 表达增强蛋白的重组杆状病毒杀虫剂不 形成多角体或多角体稀少 l对增强蛋白的结构和功能了解不够 增强蛋白与多角体形成的相互作用 增强蛋白的在细胞中的分布及机理 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 20 项目来源和研究目的 l项目来源 国家自然科学基金 39870006 l研究目的 进一步了解增强蛋白的结构和功能 更好的利 用增强蛋白提高杆状病毒的杀虫效果 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 21 主要内容 l选题背景 l实验材料和方法 l实验结果与分析 l总结与展望 粉纹夜蛾
8、颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 22 实验材料和方法 实验材料 l草地夜蛾 Spodoptera frugiperda 卵巢组织 细胞系SF21 l苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 Autographa californica NPV AcMNPV 1A分离株 l7种表达粉纹夜蛾颗粒体病毒 Trichoplusia ni Granulovirus TnGV 增强蛋白基因不同片 段的重组AcMNPV 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 23 实验材料 重组病毒基因组所插入的增强蛋白基因片段 l增强蛋白 l2CTn lPolyVEF l K l B l N E l
9、3dk l3ds His Tag 1 2706 2706bp 117 2706 2823bp 1 2706 2706bp 456 2706 2250bp 571 2706 2135bp 750 2706 1956bp 1 1976 1976bp 1 1669 1669bp 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 24 实验方法 l细胞的培养与病毒的感染方法 l杆状病毒的96孔板终点稀释法测定病毒效价 l变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE l免疫印记实验 Western Blotting l病毒感染后细胞的免疫荧光组织化学分析 l多角体的纯化和免疫荧光组织化学分析 l细胞
10、核 质的分离和制样 l细胞和多角体的记数 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 25 实验方法 l细胞的培养方法 Sf 21细胞用TNM FH培养液加10 小牛血清在27 下 恒温培养 一般每3天传一次代 每次传代比例为1 3 到1 4 l病毒的感染方法 细胞传代后24h感染病毒 保证M O I 5 感染复数 M O I 病毒效价 病毒体积 细胞密度 细胞体积 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 26 实验方法 l细胞的免疫荧光组织化学分析 细胞 2 的甲醛PBS 溶液固定 0 25 的Triton X 100溶液通透 PBS清洗 5 山羊血 清吸收
11、加入一抗溶液 1 500 0 1 的NP40 PBS溶液清洗 加入FITC标 记的二抗溶 液1 2000 清洗观察 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 27 实验方法 l细胞核 质的分离 细胞液3000 r min离心 弃上清 冰浴的PBS溶 液清洗 离心 弃上清 TM 2缓冲液 重悬细胞 0 5 Triton X 100冰浴 5mins 4 5号的针 头将此细 胞液通过3 遍 800 r min离 心10mins 沉 淀细胞核 上 清为去核液 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 28 实验方法 l多角体的纯化和预制 收集细胞 清洗 离心 2 NP4
12、0 0 2 SDS悬浮细胞 震荡 破碎细胞 离心 沉淀蔗 糖梯度密度超 速离心 收集 多角体带 玻璃研磨 器中研磨 多角体 加0 1M Na2CO3 0 05M NaCl 迅 速加酸中和 使 多角体松散 免疫荧光组 织化学方法 处理 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 29 主要内容 l选题背景 l实验材料和方法 l实验结果与分析 l总结与展望 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 30 实验结果与分析 l结果一 7种表达不同增强蛋白片段的 重组病毒与野生型AcMNPV病毒混合感染 的分析 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 31
13、 结果一 表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混 合感染的分析 表1 7种重组杆状病毒与野生型AcMNPV的病毒效价 病毒名称 病毒效价 TCID50 ml 野生型 AcMNPV 3 40 10 7 2CTn 2 30 10 7 POLYvef 3 26 10 7 B 1 98 10 7 K 1 86 10 7 N E 2 06 10 7 3dk 2 12 10 7 3ds 1 76 10 7 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 32 结果一 表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混 合感染的分析 7种重组病毒所表达的增强蛋白全长或片段的检测 1 蛋白Marker 2 POLY
14、vef 3 K 4 2CTn 5 3ds 6 3dk 7 N E 8 B SDS PAGE 抗增强蛋 白抗体免 疫印迹检 测 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 33 结果一 表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混 合感染的分析 重组病毒3ds增强蛋白表达的SDS PAGE和Western检测 各蛋白条带如下 1 分子量标准 ku 2 SDS PAGE 3 Western 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 34 结果一 表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混 合感染的分析 未感染的SF21细胞和被野生型AcMNPV感染的SF21细胞 粉纹夜蛾颗粒体病毒
15、增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 35 结果一 表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混 合感染的分析 7种重组杆状病毒与野生型AcMNPV 单独或混合感染的SF21细胞 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 36 表2 7种重组病毒分别与野生型AcMNPV混合感染SF21细 胞时产生的多角体数比较 野生型AcMNPV 2 64 107 100 00 2CTn AcMNPV 1 14 107 43 18 POLYvef AcMNPV 6 80 106 25 76 K AcMNPV 2 08 107 78 79 B AcMNPV 1 96 107 74 24 N E AcM
16、NPV 2 12 107 80 30 3dk AcMNPV 1 96 107 74 24 3ds AcMNPV 2 26 107 85 61 与野生型AcMNPV混合感染的重组病毒 产生的多角体数 个 ml 相对产量 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 37 结果一 表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混 合感染的分析 相对干扰能力 设重组病毒POLYvef的干扰多角体形成的能力为1 计算重组病毒对野生型AcMNPV形成多角体的相对干 扰能力 100 该病毒 wtAcMNPV 多角体产量 POLYvef wtAcMNPV 多角体产量 1 X 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 38 结果一 表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混 合感染的分析 图4 7种重组病毒对野生型AcMNPV形成多角体的干扰能力的比较 粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白结构与功 能的初步研究 王立娟 39 结果一 表达增强蛋白的重组病毒与野生型病毒混 合感染的分析 结论 l表达增强蛋白全长或部分片段的重组杆状病毒 对AcMNPV多角体形成有不同程度的干扰 l表达全长增强蛋白的重组病
