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1、分子技术在食品毒理学中的应用姓名：王媛专业：食品营养与检测学号：1110605045分子技术在食品毒理学中的应用摘要：本文主要对动物转基因技术发展状况作了概述，重点是近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法, 如睾丸转基因法和卵巢转基因法; 提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法作了介绍。然后对转基因技术的应用作了论述，最后对转基因技术的发展前景作了展望。关键字：动物转基因技术；应用；展望1 分子毒理学由于分子毒理学是从毒理学分支出来的，它与毒理学其它各学科的关系令人关注。分子毒理学与生化毒理学的关系十分密切，有时几乎难以区分，但前者侧重于研究基因及其表达的负面效应，而后者则侧重于
2、外源化合物的代谢。分子毒理学与药学的关系尤其是分子药理学的关系密切，两者在研究方法上大体是同样的，不过，分子药理学是研究药物的治疗作用，而分子毒理学则是研究外源化合物的有害效应。由于毒理学的研究范围并不局限于生物个体，尤其是人类的个体，而已扩大到对群体的研究，例如外源化合物对生物群体影响的研究，例如外源化合物对生物群体影响的研究，即生态分子毒理学，又如外源化合物对人群的健康影响的研究，即分子流行病学。2 分子毒理学的发展随着分子生物学的迅猛发展，分子毒理学成为近年来毒理学领域进展最快的分支学科，研究进展迅速。分子生物学新技术的开发和应用，如基因重组和克隆技术、核酸杂交技术、PCR 技术、DNA
3、 测序技术以及一系列突变检测技术已广泛用于外源化合物引起的 DNA 损害、基因突变、加合物形成、基因多态性、癌基因与抑癌基因的检测等。近 20 年来，物理、化学、数学、信息科学、环境科学和生物医学互相渗透，特别是分子生物学新概念和新技术的飞速发展，使人类对“疾病”的本质有了进一步深入的了解。随着人类基因组计划（HGP）以出人意料的速度发展，环境基因组计划（EGP）也在顺利进行，一些新技术，如差异显示技术、荧光原位杂交技术、流式细胞计技术、单细胞凝胶电泳以及穿梭质粒、转基因动物和转基因细胞等得到了充分的开发和应用，将为毒理学工作者提供全新的概念和技术，也为分子毒理学的研究带来新的启迪和前所未有的
4、机遇。在基因测定方面，由于生物芯片技术日益广泛的应用，使外源化合物诱发的基因变化，可以一步到位就能将整套改变扫描出来。借助于高通量的生物芯片和微阵列技术以及蛋白质、氨基酸电泳质谱技术，化学毒物早期敏感生物效应的标志物监测将快速、高效地进行，及时向人类提出预警信号。3 转基因动物试验3.1 定义 将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。通俗的讲：转基因技术就是指利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其它物种中，改造生物的遗传物质，使遗传物质得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变。人们常
5、说的遗传工程、 基因工程、遗传转化均为转基因的同义词 1。 3.2 常用技术 受精卵的微注射技术 是目前最常用的转基因方法之一，选用精细额显微注射针将外源基因直接注入实验动物受精卵的精原核，使外源基因整合入基因组。微注射法的总效率是比较低的，但此法仍是目前获得转基因动物的常规方法。 胚胎干细胞介导技术 胚胎干细胞是从早期胚胎的内细胞团分离出来多潜能细胞系，它具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能。当将胚胎干细胞注入受体胚体时，能参与各种组织、器官的发育，形成嵌合体。因此，它可作为一种载体，把外源基因导入个体，获得转基因动物。目前利用胚胎干细胞获得的转基因小鼠主要用于基础研究。 反转录病毒载体法
6、 反转录病毒的核酸为一条单链的 RNA 分子，当其进入细胞后，在反转录酶作用下，病毒 RNA 反转录为双链 DNA 分子，整合到细胞核基因组中。随着分子病毒学研究的深入，发现利用反转录病毒的高效感染和在宿主细胞 DNA 上的高度整合特性，可以大大提高基因转移效率。在各种基因转移方法中，通过反转录病毒载体把基因整合到受体细胞核基因组中是最有效方法之一。 其他 动物转基因技术还有脂质体介导法、电脉冲介导法、原生殖细胞介导法、细胞融合发等。3.3 转基因动物技术的应用现状转基因动物是指通过转基因技术将外源基因导入动物生殖细胞,由此稳定整合到动物基因组,并能遗传给后代的动物。目前,转基因动物的研究主要
7、包括三个方面:(1)利用转基因技术进行动物生产改良,培育新品种和提高生产性能,进行基因治疗。(2)利用转基因动物制造具有生物活性的产物,包括器官移植和生物反应器。(3)利用转基因动物确定研究手段,包括建立疾病模型和发育调控。3.3.1 促进动物生长生长激素(GH)基因是转基因研究中最早运用的,至今已生产出转基因家禽、啮齿类、鱼类、昆虫等多种属性的动物。Hammer 等 10(1985)利用显微注射法将人生长激素基因转移到兔、绵羊和猪中均获得成功。国内外大量的转基因家畜 GH 均能表达,但 GH 的表达水平在不同的转基因实验之间和同一转基因实验的不同动物个体之间差异很大。国外生产的转基因猪中 G
8、H 产物得到表达,血浆中 GH 水平持续地提高,转基因猪的生长速度比较快,饲料利用率提高 17%,胴体脂肪为对照组的 50%。20 世纪 80 年代中后期,新疆畜牧科学院与北京农业大学合作,用精子载体人工法获得了含有牛生长激素基因的转基因绵羊。结果表明,转基因绵羊比普通绵羊生长速度快,周岁体重较高。有不少研究发现,在提高动物生长速度的同时也带来了一些副作用,如在转 GH 基因动物中,死胎和畸形率较高,得关节炎、胃溃疡、肾病和繁殖力下降的转基因动物较多,这可能与转基因整合位点不当和 GH 表达水平失控有关。另外,对猪进行 GH 基因发现,较异原生长激素基因的猪生长速度快。3.3.2 改善产品品质
9、外源基因不仅能在转基因动物中得到整合和表达,而且能获得组织特异性表达,因此,只要转入相关的基因,不仅可以提高乳、肉、蛋、皮毛等畜产品的产量,而且也可以改变畜产品质量,这是常规育种和突变方法所不能完成的。在改变产乳性状方面,主要以羊和奶牛为转基因对象。西方国家如英国、美国、法国、瑞士和荷兰都已相继开展研究,并取得了一定进展。Simious 等首先用绵羊的 -乳球蛋白(BLG)基因产生了转基因小鼠并获得表达,其乳汁中所含的绵羊 -乳球蛋白的量要比正常绵羊乳汁高 5 倍。随后又用 BLG-FIX(人凝血因子 IX)和 BLG-1AT(人 1-抗胰蛋白酶)基因获得了转基因绵羊,并从其乳汁中测出了人凝血
10、因子和人 -抗胰蛋白酶。Murray 等将人乳溶菌酶基因导入小鼠获得了有活性的乳腺专一性表达,通过这一途径有可能实现对乳用家畜乳用成分的改良,乳汁成分中溶菌酶含量的提高,不仅可以减少乳畜乳房炎的发生,还能延长奶的保鲜期。在改善肉质方面,许多研究都已证实,GH 具有明显抑制脂肪生成的作用,而且还有一定的催乳特性,转有 GH 基因的家畜,体脂减少,瘦肉率明显提高,利用 GH 基因抑制脂肪生成的特性,可对瘦肉型猪进行定向育种和培育。通过一定的导入途径将 GH 基因导入产毛家畜,可提高产毛家畜的生长速度并增大其体型,进而提高产毛量。除此之外,还可以导入一些与产毛性能有关的基因,目前研究较多的是角蛋白纤
11、丝基因,与胱氨酸合成有关的丝氨酸乙酰转移酶(SAT)和 D-乙酰丝氨酸硫化脱氢酶(DAS)基因等。澳大利亚已有两个实验室正在进行这方面的研究,他们分别从大肠杆菌和沙门氏菌中分离到 SAT 和 DAS 基因并且经基因转移获得了转基因小鼠和转基因绵羊。最近已有报道,带有提高羊毛产量特征的转基因羊已产生。目前,人们开始用转基因手段培育超细型细毛羊,并准备将彩色毛基因导入绵羊以生产彩色羊毛,这无疑对羊毛生产及纺织业带来巨大影响。3.3.3 提高抗病性提高家畜生产性能和改善畜产品质量一样,利用转基因技术提高动物的抗病性具有十分乐观的应用前景。在对各种动物的抗病基因转移研究中,以对鸡的抗病效果较显著 11
12、,12。1989 年美国农业部以禽白血病病毒(ALV)为载体,获得了抗 ALV 的新品系鸡。王敏华等报道,用 OMT 与抗猪瘟病毒的核酶基因相融合,经基因转移后用以指导抗猪瘟病毒的核酶基因在转基因兔中的表达,检测表明,转基因兔获得了一定表达。3.3.4 动物生物反应器一般把目的基因在血液循环系统或乳腺中表达的转基因动物叫动物生物反应器,转基因最为诱人的前景是利用他生产人类所需的生物活性物质或药用珍稀蛋白,这已引起了国内外学者和开发商的高度重视。Sharma 等(1994)用同源性猪 猪蛋白基因作启动子连接人的 猪蛋白基因做组编码区在转基因猪中高效表达人的血红蛋白,这表明通过转基因猪大规模生产人
13、血红蛋白是可能的。目前已成功在山羊、猪和绵羊乳中生产出组织血纤维蛋白溶酶原激活因子和抗凝血因子(t-PA),血凝集因子和以及蛋白 C。在转基因家畜血液中得到了人免疫球蛋白 1 球蛋白、 球蛋白、干扰素、胰蛋白酶和生长激素等,而且这些蛋白都具有正常的生物活性。3.3.5 器官移植器官移植按供体与受体遗体距离的远近可分为两种类型:相近种系和远离种系间异种器官移植。异种器官移植排异反应甚为迅速和剧烈,例如:异种移植的心脏在几分钟至几小时内即可被排斥而丧失功能。为了防止补体介导的异种移植后超级排异反应,近年来,国外学者提出了两条途径:一条途径是通过对受体动物循环血中的补体清除,使供体心脏不受补体的攻击
14、。首先采用此法进行猪-猴心脏移植达到了延长心脏存活的目的。另一条途径是通过转基因技术,即通过克隆受体的补体调节蛋白基因并转移至供体动物基因组中,使之在供体心血管内上皮表达,采用这种转基因动物心脏进行异种移植后,就可避免超级排异反应的发生,其效果类似于同种心脏移植。3.3.6 建立人类遗传疾病模型进行基因治疗基因治疗主要是将正常的外源基因植入人体靶细胞以取代有缺陷的基因,恢复该基因的功能或提供一种新的治疗功能,以改善相关症状,达到治疗基因病的目的。最早的基因治疗可追溯到 20 世纪 80 年代初。80 年代后期,从小鼠到灵长类等一系列动物基因转移研究模型获得成功。我国基因治疗研究始于 80 年代
15、末,1987 年成立了第一个进行基因治疗研究的实验室,短短几年内,已取得显著的成绩,首例基因治疗血友病患者获得成功(1991)。3.4 应用前景转基因动物是对多种生命现象本质深入了解的工具，如研究基因的结构与功能的关系等。 可以用来建立多种疾病的动物模型，进而研究这些疾病的发病机理及治疗方法。 能提高动物育种效率。转基因动物技术使家畜、家禽的经济性状改良更加有效，如使生长速度加快、瘦肉率提高，肉质改善，饲料利用率提高，抗病力加强等。 转基因动物可作为医用或食用蛋白的生物反应器。可以通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白。 结语：未来转基因技术在猪、牛、羊、兔等家畜中获得成功,并已得到初步应用,但目前还存在一系列问题制约着转基因动物的生产规模,限制着转基因动物产品的研究与开发。存在的问题有:成本高,效率低;转基因的表达不理想;目的基因与动物生产性状的多基因矛盾突出;社会对转基因动物的可接受性还有待于进一步论证等。虽然转基因技术还存在一定的局限性,但经过几十年的发展,转基因动物的研究取得了长足的进步,研究方法也日新月异,在各个领域展现出美好的前景。许多生物学家预言“21 世纪将是人类向生物技术要粮食、要奶、肉、蛋的世纪”,利用转基因动物造福人类的前景无疑是光明而诱人的。
