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1、20学时,安徽农业大学生命科学学院,高俊山,花药培养：是指将未成熟的花药接种在人工培养基上分化成为植株的过程。属于器官培养。,常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。,一、实验目的与原理,原理： 利用组织培养技术对植物花药进行离体培养，诱导产生再生植株。通过形态观察和染色体分析鉴定单倍体植株，作为新的遗传资源和选择材料。,目的：掌握植物花药离体培养技术；掌握单倍体植株鉴定的方法；了解单倍体育种的意义。,花药培养基本流程：,二、实验内容1、镜检花粉发育时期2、花药离体培养 2.1 取样 2.2 消毒 2.3 接种 2.4 培养3、单倍体植株的鉴定,三、实验器材材料：烟草花药。试剂：MS
2、培养基、N6培养基、B5培养基、酒精、2,4-D、NAA、KT、蔗糖、醋酸洋红、蒸馏水。仪器：电子天平、磁力加热搅拌器、普通光学显微镜、微波炉、pH计、培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、镊子、剪刀、解剖针、烧杯、试剂瓶、三角瓶、封口膜、橡皮筋、低温冰箱。,四、实验步骤1.适期花药的选择,花药中的花粉是由生殖细胞（体细胞）经过减数分裂而来，其染色体只是体细胞中的一半，如果通过一定的途径将花粉培养成植株，获得单倍体植株。再经过染色体加倍，得到纯合的二倍体，大大缩短育种进程。,一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。,形成双核后，在合适的条件下，主要由营养细胞分裂产生胚状体
3、。,花粉发育时期： 被子植物的花粉发育可分为四分体期、单核期（小孢子期）、二核期和三核期（雄配子期）4个时期。,四分体时期,单核靠边期,花药切片显微观察,四分体: 醋酸洋红染色,四分体: Alexanders 染色,单核期,双核期,成熟花粉粒,烟草花粉发育时期的检测： 一般将植物的花药置于载玻片上压碎，加1-2滴1%醋酸洋红染色，再进行镜检，以确定花粉发育时期。,处于不同发育阶段的烟草花芽,烟草花粉发育时期的确定,烟草花粉培养，选择单核靠边期的花药，培养效果最好。,从烟草花的外部形态变化来看，当花蕾的花冠长度与花萼的长度相等时，花药里面的多数花粉粒正处于单核靠边的阶段。,不同物种诱导胚胎发生的
4、最佳小孢子发育时期,2.花药离体培养,（1）取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。（考虑供体植物基因型、生理状态）（2）消毒 70酒精擦洗花蕾表面，70酒精浸泡15-30s后，在1次氯酸钠溶液中浸泡8-10min或在0.1的氯化汞溶液中消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次。（3）接种 剥去萼片和花瓣，将花药取出。去除花丝，但不应使花药受到损伤。（4）培养 先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。,花药培养过程,取花蕾（镜检）,预处理,取花药,接种, 预处理 预处理是小孢子培养成功的前提条件。 预
5、处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。 预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。,烟草花药培养，4低温预处理2-3天。, 培养基,主要为MS、H、N6、B5和Nitsch培养基，在此基础上发展出一些其它的培养基。,H培养基（基本成分+ 6-BA/KT 2mg/L+ NAA/2,4-D 0.2mg/L+ 30g/L蔗糖+ 7g/L琼脂+ 1g/L活性炭，pH值5.5-5.8）上诱导愈伤组织；愈伤组织形成后转移到H培养基（ 基本成分+ NA
6、A 2mg/L+ 6-BA 0.2mg/L+ 20g/L蔗糖+ 7g/L琼脂）上分化成苗。 1/2 MS培养基+ 激素+ 蔗糖+ 琼脂+ 活性炭,高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。铁盐对花粉胚状体发育很重要。活性炭促进胚状体发育。 较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织；较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。细胞分裂素可促进胚状体形成；生长素可诱导愈伤组织形成。细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗。氨基酸有机附加物,H培养基的配制,MS培养基的配制, 培养条件,1、温度 适宜温度是2528，一般不应低于25。2、光照 每天 12小时光照,光强为 1800-2000lx。3、接种密度
7、每瓶接种花药多少，应根据三角瓶的大小来决定。50mL三角瓶一般接种10个花药。,1、胚状体发育途径 小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。2、愈伤组织发育途径 小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。, 花粉植株形态发生方式,单倍体植株的发育方式,胚状体发育途径,部分花药通过胚状体途径形成小植株。,烟草花药培养,A：从裂开的花药中长出胚状体; B、C：从药室中直接长出的幼苗;D、E：具有根、茎、叶的小苗; F：小苗发达的根系,愈伤组织发育途径,部分花药产生愈伤组织,接种在平板上的水稻花药,水稻花药培养,愈伤组织转接种到再生培养基,愈伤
8、组织分化形成再生植株, 白化苗现象,（一）白化苗产生的影响因素及机理1、内因 供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。2、外因 预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。3、机理 核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。（二）白化苗的控制 通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。,3.单倍体植株的鉴定 通过花药培养获得的再生植株的染色体数目也常发生变异，其后代常是混倍体，所以必须对其后代进行鉴定。 鉴定方法既可以根据形态特征进行间接鉴定，也可以镜检体细胞中的染色体数或花粉母细胞中染色体数以及
9、染色体配对的情况进行直接鉴定。此外还可以根据花粉的育性或利用遗传标记性状进行鉴定。（1）染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织用醋酸洋红染色进行制片，直接计数染色体数目。,（2）间接鉴定（1）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。（2）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。（3）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪） 主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性。（4）杂交鉴定法自交或测交鉴定 根据后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。（5）分子标记鉴定 包括生化标记（如同
10、工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）。,醋酸洋红染色法观察植物根尖细胞染色体,实验步骤：1、取材：烟草根尖。2、预处理：冷冻处理。 根尖置于冰水浴中，放到4的冰箱中处理24小时。3、固定 冲洗干净处理的材料，卡诺氏液（冰乙酸：无水乙醇=1：3或冰乙酸：氯仿：无水乙醇=1；3：6）固定24h。4、解离 取出4-5条根置于表面皿中，用蒸馏水冲洗3-4次，加入数滴1N盐酸于表面皿中，在酒精灯上间歇式加热2-4分钟。5、染色 加几滴醋酸洋红于表面皿内，在灯上加热。取一根已染过色的根放在载玻片上，加一滴1%醋酸洋红溶液，盖上盖玻片轻敲盖玻片，使根尖压成一薄层。6、镜检 先在10倍下找
11、到分裂相后，再换40倍观察。,四、注意事项1. 提高诱导效率。2. 降低白化苗的发生频率。五、作业与思考题1. 花药培养的一般程序；附培养结果（照片）2. 影响花药培养的因素；诱导率/ %=(愈伤组织数/接种花药数)100出苗率/ %=(花药出苗数/接种花药数)1003. 单倍体植株的鉴定方法；4. 单倍体育种的意义和不足之处。,胚状体形成：MS培养基（1/2大量元素+基本成分）+ NAA 0.2mg/L + 6-BA 2mg/L + 30g/L蔗糖+ 7g/L琼脂+ 1g/L活性炭，pH值5.5-5.8）,分化成苗：MS培养基（1/2大量元素+基本成分）+ NAA 2mg/L + 6-BA 0.2mg/L + 20g/L蔗糖+ 7g/L琼脂，pH值5.5-5.8 ）,胚状体形成：H培养基（基本成分）+ NAA 0.2mg/L + 6-BA 2mg/L + 30g/L蔗糖+ 7g/L琼脂+ 1g/L活性炭，pH值5.5-5.8）,分化成苗：H培养基（1/2大量元素+基本成分）+ NAA 2mg/L + 6-BA 0.2mg/L + 20g/L蔗糖+ 7g/L琼脂，pH值5.5-5.8 ）,
