分子发光分析法荧光磷光和化学发光

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1、2020年1月20日星期一 1 第七章分子发光分析法 molecularluminescenceanalysis 第一节分子荧光与磷光molecularfluorescenceandphosphorescence第二节分子荧光与磷光分析法molecularfluorescenceandphosphorescenceanalysis第三节化学发光分析法chemiluminescenceanalysis 2020年1月20日星期一 2 一 分子荧光与磷光产生过程luminescenceprocessofmolecularfluorescencephosphorescence二 激发光谱与荧光光谱e

2、xcitationspectrumandfluore scencespectrum三 荧光的产生与分子结构关系relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure四 影响荧光强度的因素factorinfluencedfluorescence 第一节分子荧光与磷光 molecularfluorescenceandphosphorescence 2020年1月20日星期一 3 一 荧光与磷光的产生过程luminescenceprocessofmolecularfluorescenceandphosphorescence 由分子结构理论 主要讨论荧光及磷光

3、的产生机理 1 分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂 在每个电子能级上 都存在振动 转动能级 基态 S0 激发态 S1 S2 激发态振动能级 吸收特定频率的辐射 量子化 跃迁一次到位 激发态 基态 多种途径和方式 见能级图 速度最快 激发态寿命最短的途径占优势 第一 第二 电子激发单重态S1 S2 第一 第二 电子激发三重态T1 T2 2020年1月20日星期一 4 2 电子激发态的多重度 电子激发态的多重度 M 2S 1 S为电子自旋量子数的代数和 0或1 例如 钠只有一个外层电子 S 1 2 因此M 2 1 2 1 2 所以将产生双重线 若为碱土金属 有两个外层电子 它们可能同一个方向自旋

4、 则S 1 2 1 2 1 M 3 为三重线 或者向相反方向自旋 S 1 2 1 2 0 M 1 为单重线 平行自旋比成对自旋稳定 洪特规则 三重态能级比相应单重态能级低 大多数有机分子的基态处于单重态 通常用S和T分别表示单重态和三重态 S0 T1禁阻跃迁 通过其他途径进入 见能级图 进入的几率小 2020年1月20日星期一 5 2 激发态 基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态 返回基态时 通过辐射跃迁 发光 和无辐射跃迁等方式失去能量 激发态停留时间短 返回速度快的途径 发生的几率大 发光强度相对大 荧光 10 7 10 9s 第一激发单重态的最低振动能级 基态 磷光 10 4

5、10s 第一激发三重态的最低振动能级 基态 2020年1月20日星期一 6 2020年1月20日星期一 7 非辐射能量传递过程 振动弛豫 同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁 发生振动弛豫的时间10 12s 内转换 同多重度电子能级中 等能级间的无辐射能级交换 通过内转换和振动弛豫 高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级 外转换 激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁 外转换使荧光或磷光减弱或 猝灭 系间跨越 不同多重态 有重叠的转动能级间的非辐射跃迁 改变电子自旋 禁阻跃迁 通过自旋 轨道耦合进行 2020年1月20日星期一

6、8 辐射能量传递过程 荧光发射 电子由第一激发单重态的最低振动能级 基态 多为S1 S0跃迁 发射波长为 2的荧光 10 7 10 9s 由图可见 发射荧光的能量比分子吸收的能量小 波长长 2 2 1 磷光发射 电子由第一激发三重态的最低振动能级 基态 T1 S0跃迁 电子由S0进入T1的可能过程 S0 T1禁阻跃迁 S0 激发 振动弛豫 内转换 系间跨越 振动弛豫 T1发光速度很慢 10 4 100s 光照停止后 可持续一段时间 2020年1月20日星期一 9 二 激发光谱与荧光 磷光 光谱excitationspectrumandfluore scencespectrum 荧光 磷光 光致

7、发光 必须选择合适的激发光波长 激发光波长如何选择 1 荧光 磷光 的激发光谱曲线由于分子对光的选择性吸收 不同波长的入射光具有不同的激发效率 如果固定荧光 或磷光 的发射波长 即测量波长 而不断改变激发光 即入射光 的波长 并记录相应的荧光 或磷光 强度 所得到的发光强度对激发波长的谱图称为荧光 或磷光 的激发光谱 图中曲线I 如果固定激发光的波长和强度而不断改变荧光 或磷光 的测量波长 即发射波长 并记录相应的荧光 或磷光 的强度 所得到的发光强度对发射波长的谱图则为荧光 或磷光 的发射光谱 2020年1月20日星期一 10 2 荧光光谱 或磷光光谱 固定激发光波长 选最大激发波长 化合物

8、发射的荧光 或磷光强度 与发射光波长关系曲线 图中曲线II或III 激发光谱和发射光谱可作为发光物质的鉴别手段 并可用于定量测定时作为选择合适的激发波长和测量波长的依据 2020年1月20日星期一 11 应该指出 激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同 但前者是荧光强度与波长的关系曲线 后者则是吸光度与波长的关系曲线 两者在性质上是不相同的 当然激发光谱曲线的最高处 处于激发态的分子数目最多 这可说明所吸收的光能量也是最多的 自然能产生最强的荧光 2020年1月20日星期一 12 2020年1月20日星期一 13 3 激发光谱与发射光谱的关系 a Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值 发

9、射光谱的波长比激发光谱的长 振动弛豫消耗了能量 b 发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级 吸收不同波长的能量 如能级图 2 1 产生不同吸收带 但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态 产生波长一定的荧光 如 2 c 镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱 与激发光谱形状一样 成镜像对称关系 2020年1月20日星期一 14 镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似 基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大 相反跃迁也然 2020年1月20日星期一 15 应用镜像对称规则 可以帮助判别某个吸收带究竟是属于第一吸收带中

10、的另一振动带 还是更高电子态的吸收带 根据镜像对称规则 如不是吸收光谱镜像对称的荧光峰出现 表示有散射光或杂质荧光存在 诚然 也存在少数偏离镜像对称规则的现象 究其原因 或是由于激发态时核的几何构型与基态时不同 或是由于在激发态时发生了质子转移反应或形成激发态二聚体 或激发态复合物 等原因而引起的 2020年1月20日星期一 16 200 250 300 350 400 450 500 荧光激发光谱 荧光发射光谱 nm 蒽的激发光谱和荧光光谱 2020年1月20日星期一 17 三 荧光的产生与分子结构的关系relationbetweenfluorescenceandmolecularstruc

11、ture 1 分子产生荧光必须具备的条件 1 具有合适的结构 2 具有一定的荧光量子产率 荧光量子产率 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关 如外转换过程速度快 不出现荧光发射 2020年1月20日星期一 18 2 化合物的结构与荧光 1 跃迁类型 的荧光效率高 系间跨越过程的速率常数小 有利于荧光的产生 2 共轭效应 提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 3 刚性平面结构 可降低分子振动 减少与溶剂的相互作用 故具有很强的荧光 如荧光素和酚酞有相似结构 荧光素有很强的荧光 酚酞却没有 4 取代基效应 芳环上有供电基 使荧光增强 如 OH NH2 OCH3 NR2等 吸电子基团如

12、 NO2 COOH等减弱荧光 程度高时 无荧光 2020年1月20日星期一 19 2020年1月20日星期一 20 5 取代基的空间障碍对荧光也有影响 一般空间阻碍导致荧光减弱 立体异构现象对荧光强度有显著的影响 一般反式荧光强 顺式弱或无荧光 6 金属螯合物的荧光除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外 大多数无机盐类金属离子 在溶液中只能发生无辐射跃迁 因而不能产生荧光 但是 在某些情况下 金属螯合物却能产生很强的荧光 并可用于痕量金属离子的测定 主要是由于螯合物中配位体的发光 一般来说 能产生这类荧光的金属离子具有硬酸型结构 如Be Mg Al Zr Th等 2020年1月20日星期一

13、 21 四 影响荧光强度的因素factorsaffectingfluorescenceintensity 影响荧光强度的外部因素1 溶剂的影响除一般溶剂效应外 溶剂的极性 氢键 配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化 极性大 荧光强 2 温度的影响荧光强度对温度变化敏感 温度增加 外转换去活的几率增加 3 溶液pH对酸碱化合物 溶液pH的影响较大 需要严格控制 2020年1月20日星期一 22 4 内滤光作用和自吸现象 自吸现象 化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠 产生自吸收 如蒽化合物 内滤光作用 溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光 如色胺酸中的重铬酸钾 202

14、0年1月20日星期一 23 5 溶液荧光的猝灭 碰撞猝灭 是荧光熄灭的主要原因 它是指处于单重激发态的荧光分子与熄灭剂发生碰撞后 使激发态分子以无辐射跃迁方式回到基态 因而产生熄灭作用 荧光熄灭的程度主要取决于荧光分子与熄灭剂的反应速度和熄灭剂的浓度 另外碰撞猝灭还与溶液的黏度有关 黏度大 熄灭作用小 碰撞熄灭随温度的升高而增加 能量转移使荧光猝灭 氧的熄灭作用 溶液中的溶解氧常对荧光产生熄灭作用 这可能是由于顺磁性的氧分子与处于单重激发态的荧光物质分子相作用 促进形成顺磁性的三重态荧光分子 即加速系间跨越所致 2020年1月20日星期一 24 一 仪器与结构流程instrumentandge

15、neralprocess二 荧光分析法和应用fluorescenceanalysisandapplication三 磷光分析法的应用phosphorescenceanalysisandapplication 第二节分子荧光与磷光分析法 molecularfluorescenceandphosphorescenceanalysis 2020年1月20日星期一 25 一 仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由四个部分组成 激发光源 样品池 双单色器系统 检测器 特殊点 有两个单色器 光源与检测器通常成直角 基本流程如图 单色器 选择激发光波长的第一单色器和选择发射光 测量 波长的第二单色器 光源 氙灯

16、和高压汞灯 染料激光器 可见与紫外区 检测器 光电倍增管 2020年1月20日星期一 26 仪器光路图 2020年1月20日星期一 27 仪器框图 该型仪器可进行荧光 磷光和发光分析 2020年1月20日星期一 28 同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系 同步扫描可分为固定波长差 和固定能量差及可变波长三种 同步扫描技术可简化光谱 谱带变窄 减少光谱重叠 提高分辨率 如图 合适的 可减少光谱重叠 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似 发射光谱严重重叠 但 60nm时 只显示色氨酸的特征光谱 实现分别测定 2020年1月20日星期一 29 可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧 磷 光光谱图 2020年1月20日星期一 30 磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量 在有荧光发射的同时测量磷光 测量方法 1 通常借助于荧光和磷光寿命的差别 采用磷光镜的装置将荧光隔开 2 采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术 室温测量时 不需要杜瓦瓶 英国化学家 物理学家杜瓦发明的瓶子 2020年1月20日星期一 31 二 荧光分析方法与应用 1