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1、八五三农场职工医院检验科 文件编号：BWS-07-01-001第 1 页 共 3 页作业指导书第 3 版 第 0 次修订文件名称：双抗原夹心 ELISA 方法检测艾滋病病毒抗体标准操作规程 实施日期：2007-7-11双抗原夹心 ELISA 方法检测艾滋病病毒抗体标准操作规程1、目的规范抗-HIV 抗体检测操作程序。2、适用范围本实施细则使用于对人类血清或血浆中艾滋病毒抗体的初筛检测。3、原理采用夹心 ELISA 方法检测血清或血浆样品中人类免疫缺陷病毒 HIV（1+2 型）抗体，预包被高纯度重组 HIV（1+2 型）抗原，待检血清中的抗 HIV 抗体与包被抗原反应，再与酶标 HIV-1+2
2、型抗原结合，形成抗原-抗体- 酶标抗原复合物，加底物（TMB）显色，在酶标仪上测定 OD 值，根据 OD 值判定有无 HIV 抗体的存在。4、环境条件室温 18-25。室内相对湿度 30-605、试剂与材料5.1、吸水纸；5.2、说明书 1 份；5.3、HIV 抗原包被板 1 块，每板 12 条，每条 8 孔；5.4、HIV 酶标抗原工作液 1 瓶；5.5、50 倍浓缩洗液 1 瓶；5.6、HIV 阳性对照（已灭活）1 支；5.7、HIV 阴性对照 1 支；5.8、底物液 A 1 瓶；5.9、底物液 B 1 瓶；5.10、终止液 1 瓶；5.11、封口胶 2 张；5.12、塑料袋 1 个；5.
3、13、 （新鲜）蒸馏水或去离子水；5.14、一次性 V 型水槽；5.15、一次性瓶（塑料） ，用于准备 TMB 底物液；5.16、一次性乳胶手套；5.17、记时器；5.18、5次氯酸钠或其他认可消毒液；5.19、适用盛装有可能受污染的物品的容器；5.20、尿过氧化物溶液 2 瓶，每瓶 11ml。6、仪器6.1、酶标仪；6.2、水浴箱（35-39） ；6.3、离心机；6.4、洗板机；八五三农场职工医院检验科 文件编号：BWS第 2 页 共 3 页作业指导书第 3 版 第 0 次修订文件名称：双抗原夹心 ELISA 方法检测艾滋病病毒抗体标准操作规程 实施日期：2007-7-116.5、打印机。7
4、、操作步骤7.1、使用前将试剂盒从冰箱中取出平衡至室温，取出所须板条，剩余的及时封存放回冰箱。7.2、每次实验均须设立空白对照孔 2 孔，不加样品和酶结合物，只加底物和终止液；抗-HIV 阳性对照孔 3 孔，每孔 50 或 100l。7.3、其余各孔加待检测标本 50 或 100l。7.4、覆盖粘胶纸，置 37孵育 30 或 60 分钟。7.5、将 50 倍浓缩洗液用纯化水 50 倍稀释后备用。7.6、取出已孵育完毕的反应板，弃去粘胶纸，放入洗板机中，吸干板内液体，将洗涤液注满酶孔（约 300l/孔） ，吸干，反复 5 次，在干净纱布上将板拍干。7.7、除空白孔外，每空加入酶标抗原工作液 50
5、 或 100l，贴上封口胶。37温育 20 或30 分钟。7.8、洗涤同步骤 7.6。7.9、每孔加入底物缓冲液 A50l、TMB B50l，混匀，置 37显色 10 分钟。7.10、加终止液 50l 振荡反应板 5 秒种，使之充分混匀。7.11、在酶标读数仪中，取波长 450nm（建议使用双波长酶标仪比色，参考波长 630nm） ，以空白对照孔校零，读取每孔吸收值（加终止液后，务必在 15 分钟内读数完毕） 。8、质量控制与评价8.1、抗 HIV 阳性对照 OD 值0.8，抗 HIV 阴性对照 OD 值0.08 或 0.12。8.2、阳性对照 OD 值有效范围：0.50。8.3、阴性对照 O
6、D 值有效范围：0.10。8.4、阴、阳性对照和被检样本的 OD 值减去空白对照 OD 值即为计算值。8.5、临界值（CUT OFF）=0.10 或 0.15+阴性对照 OD 均值。8.6、样品 OD 值临界值者为 HIV 抗体阳性，初试阳性应重新取样双孔复试，复试阳性者应按照“全国 HIV 检测管理规范”送“HIV 确认实验室”进行确认实验。8.7、样品 OD 值临界值者为 HIV 抗体反应阴性。8.8、阴性对照值若小于 0.02，以 0.02 计算。8.9、被检样本的 OD 值临界值判为 HIV 抗体阳性。8.10、每次实验必须做外部质控。8.11、质控血清有明确的标记，保存-20以下。9
7、、说明9.1、本试剂的使用单位必须是经当地卫生部门批准的 HIV 初筛实验室。9.2、整个检测工作必须符合 HIV 实验室管理规范和生物安全守则规定，严格防止交叉感染。9.3、标本和酶结合物均应加样器加注，并经常校对其准确性。9.4、所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按传染物处理。9.5、洗涤液若出现结晶，可置 37溶解。9.6、粘胶纸不能反复使用。9.7、微孔条从冷藏环境中取出时，应在室温平衡至无潮气方可使用，未用完的须放入有干燥剂的密封袋中保存。八五三农场职工医院检验科 文件编号：BWS第 3 页 共 3 页作业指导书第 3 版 第 0 次修订文件名称：双抗原夹心 ELISA 方法检测艾滋病
8、病毒抗体标准操作规程 实施日期：2007-7-119.8、洗涤时各孔须加满液体，防止孔口有游离酶不能洗净。使用洗板机洗涤应设定 30-60秒浸泡时间。9.9、HIV 检测结果的判定必须以酶标仪的读数为准。建议用双波长 450/630nm 检测。9.10、不同批号的试剂组不可混用。10、方法编写依据10.1、GB16000-1995。10.2、 全国艾滋病检测技术规范 。10.3、科华、吉比爱、梅里埃、万泰、丽珠 HIV1+2 抗体诊断试剂使用说明书。编写： 审核： 批准：批准日期： 年 月 日 实施日期： 年 月 日八五三农场职工医院检验科 文件编号：BWS-07-01-001第 1 页 共
9、2 页作业指导书第 3 版 第 0 次修订文件名称：酶联免疫法 ELISA 方法检测乙型肝炎表面抗原标准操作规程 实施日期：2007-7-11酶联免疫法 ELISA 方法检测乙型肝炎表面抗原标准操作规程1、目的规范乙型肝炎表面抗原检测操作程序。2、适用范围本实施细则使用于对人类血清或血浆的乙型肝炎表面抗原初筛检测。3、原理采用单克隆抗-HBs 包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗-HBs-HRP，当标本中存在 HBsAg 时，该 HBsAg 与包被抗-HBs 结合并与抗-HBs-HRP 结合形成抗-HBs-HBAg-抗-HBs-HRP 复合物，加入 TMB 底物产生显色反应，反之则无显色
10、反应。4、环境条件温 18-25。室内相对湿度 30-605、试剂与材料5.1、吸水纸；5.2、说明书 1 份；5.3、HBsAg 包被板 1 块，每板 12 条，每条 8 孔；5.4、HBsAg 酶标抗体工作液 1 瓶；5.5、25 倍浓缩洗液 1 瓶；5.6、HBsAg 阳性对照（已灭活）1 支；5.7、HBsAg 阴性对照 1 支；5.8、显色剂 A 1 瓶；5.9、显色剂 B 1 瓶；5.10、终止液 1 瓶；5.11、封口胶 2 张；5.12、 （新鲜）蒸馏水或去离子水；5.13、一次性 V 型水槽；5.14、一次性瓶（塑料） ，用于准备 TMB 底物液；5.15、一次性乳胶手套；5
11、.16、记时器；5.17、5次氯酸钠或其他认可消毒液；5.18、适用盛装有可能受污染的物品的容器；5.19、尿过氧化物溶液 2 瓶，每瓶 11ml。6、仪器6.1、酶标仪；6.2、水浴箱（35-39） ；6.3、离心机；6.4、洗板机；6.5、打印机。八五三农场职工医院检验科 文件编号：BWS第 2 页 共 2 页作业指导书第 3 版 第 0 次修订文件名称：酶联免疫法 ELISA 方法检测乙型肝炎表面抗原标准操作规程 实施日期：2007-7-117、操作步骤7.1、使用前将试剂盒从冰箱中取出平衡至室温，取出所须板条，剩余的及时封存放回冰箱。7.2、每次实验均须设立空白对照孔 1 孔，不加样品
12、和酶结合物，只加底物和终止液；每孔加入阴性对照（或阳性对照）各 50ul（或 1 滴） 。7.3、其余各孔加待检测标本 50ul。7.4、每孔加入酶结合物 50ul（或 1 滴）充分混匀，覆盖粘胶纸，置 37孵育 30 分钟。7.5、将蒸馏水作 25 倍稀释后备用。7.6、取出已孵育完毕的反应板，弃去粘胶纸，放入洗板机中，吸干板内液体，将洗涤液注满每孔（约 300l/孔） ，吸干，反复 5 次，在干净纱布上将板拍干。7.7、每孔加显色剂 A 液、B 液各 50ul（或 1 滴） ，充分混匀，贴上封口胶。37温育 15 分钟。7.8、每孔加入终止液 50l（或 1 滴） ，振荡反应板 5 秒钟，
13、使之充分混匀。7.9、在酶标读数仪中，取波长 450nm（建议使用双波长酶标仪比色，参考波长 630nm） ，先以空白对照孔校零，读取每孔 OD 值（加终止液后，务必在 15 分钟内读数完毕） 。8、质量控制与评价8.1、HBsAg 阳性对照 OD 值2.1，HBsAg 阴性对照 OD 值2.1。8.2、阳性对照 OD 值有效范围：2.1。8.3、阴性对照 OD 值有效范围：0.05。8.4、阴、阳性对照和被检样本的 OD 值减去空白对照 OD 值即为计算值。8.5、阴性对照值若小于 0.05，以 0.05 计算。 。9、注意事项9.1、从冷藏环境中取出的试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔
14、反应条应置 37平衡 30 后方可使用，余者应及时封存于冰箱中以备后用。在平衡试剂的同时，待测标本需室温平衡 30 分钟后再行测试。9.2 使用前试剂应摇匀，并弃去 12 滴后垂直滴加。3、封片不能重复使用。4、结果判断须在反应终止后 10 分钟内完成。5、不同批号试剂不可混用。6、待测标本不可用 NaN3 防腐。7、本试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。10、贮存条件和有效期试剂盒应置 28中避光保存，有效期十二个月。国药准字 S10910105（48 人份） 国药准字 S10910105（96 人份）10、方法编写依据10.1、GB16000-1995。10.2、 全国
15、临床检验操作规程 。10.3、科华、吉比爱、梅里埃、万泰、丽珠 HBV 抗体诊断试剂使用说明书。编写： 审核： 批准：批准日期： 年 月 日 实施日期： 年 月 日八五三农场职工医院检验科 文件编号：BWS-07-01-001第 1 页 共 2 页作业指导书第 3 版 第 0 次修订文件名称：酶联免疫法 ELISA 方法检测乙型肝炎表面抗体标准操作规程 实施日期：2007-7-11酶联免疫法 ELISA 方法检测乙型肝炎表面抗体标准操作规程1、目的规范乙型肝炎表面抗体检测操作程序。2、适用范围本实施细则使用于对人类血清或血浆的乙型肝炎表面抗体初筛检测。3、原理采用纯化单克隆 HBsAg 包被反应板，加入待测标本，同时加入 HBsAg-HRP，当标本中存在抗-HBs 时，该抗-HBs 与包被 HBsAg 结合并与酶结合物结合形成 HBsAg 复合物，加入 TMB 底物产生显色反应，反之则无显色反应。4、环境条件温 18-25。室内相对湿度 30-605、试剂与材料5.1、吸水纸；5.2、说明书 1 份；
