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1、受体植物离体培养再生体系的建立 植物基因转化受体系统 植物基因转化受体系统的条件植物基因转化受体系统的类型及特性植物基因转化受体系统的建立植物基因转化受体系统常见的问题及其解决途径 植物基因转化受体系统 植物基因转化受体 genetransformationreceptor 系统 一般是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径 能高效 稳定地再生无性系 并能接受外源基因 foreigngene 的整合 recombination 对用于转化选择的抗生素敏感的再生系统 高效稳定的再生能力较高的遗传稳定性具有稳定的外植体来源抗生素敏感性农杆菌敏感性 植物基因转化受体系统的条件 一 高
2、效稳定的再生能力 用于植物基因转化的外植体 必须易于再生 有很高的再生频率 并且具有良好的实验稳定性和重复性 不同植物的种类 细胞类型 细胞状态 特定的植物培养技术的成熟程度等在建立受体系统时均需考虑 二 较高的遗传稳定性 通过遗传转化导入外源基因的目的是在保持物种原有性状不变的基础上增加某一 些 性状或对某一特定性状进行改良 因此 植物受体系统接受外源DNA后不影响其自身的遗传体系 同时又能稳定地将外源基因遗传给后代 保持遗传的稳定性十分重要 三 具有稳定的外植体来源 基因转化的频率较低 需要多次反复的实验 所以就需要大量的外植体材料 只有稳定的外植体来源 才能够方便科学研究的进行 并从材料
3、的源头上提高实验结果的重现性 便于对实验结果的总结 转化的外植体一般采用种子 无菌实生苗的胚轴 子叶或幼叶 可进行离体快速繁殖的材料如一些植物的试管苗 以及可较高频率诱导的营养变态器官等 四 抗生素敏感性 植物基因转化中 通常使用两类抗生素 抑菌抗生素选择性抗生素选择性抗生素应满足以下条件 植物受体材料对所选用的抗生素有一定的敏感性 抗生素对受体植物没有剧烈的毒性 五 农杆菌敏感性 农杆菌介导的基因转化由于具有转化效率高 多为单拷贝插入等优点 是常用的植物基因转化方法对于利用农杆菌Ti或Ri质粒为载体所介导的植物基因转化而言 需要植物受体材料对农杆菌敏感 即受体应是农杆菌的天然宿主 这样才能更
4、容易接受外源基因 选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统对农杆菌侵染的敏感性 敏感的才能作为受体系统 根瘤农杆菌及其诱导产生的冠瘿瘤 植物基因转化受体系统的类型及特性 经过愈伤组织的受体系统不经过愈伤组织的受体系统原生质体再生系统细胞系及其体细胞胚受体系统生殖细胞受体系统 经过愈伤组织的受体系统 经过愈伤组织的受体系统是指经过愈伤组织的受体系统是指外植体经脱分化培养诱导愈伤组织 转化 并通过分化培养获得再生植株的受体系统 包括 外植体先诱导形成愈伤组织 再利用愈伤组织转化外源基因 进而再生植株利用农杆菌直接侵染外植体 经过培养形成愈伤组织 再分化成植株 特点外植体来源广泛 扩繁量大 可获得较多的
5、转化植株 适用的植物范围广 从愈伤组织分化的不定芽的多细胞起源特点 形成嵌合体较多 一种含有两种以上基因型组织的机体 可能是基因突变 染色体异常分离或移植的结果 再生植物无性系变异较大 转化的外源基因遗传稳定性较差 注意问题直接使用外植体组织进行农杆菌侵染时 应注意从活跃生长的植物部位取材 用愈伤组织进行转化 应在愈伤组织细胞处于分生细胞状态时进行转化 此时易于接受外源基因 转化效率高 愈伤组织必须保持良好的生长状态 继代周期不能太长 不经过愈伤组织的受体系统 不经过愈伤组织的受体系统也称直接分化再生系统 是指外植体细胞越过脱分化阶段 直接分化出不定芽 从而获得再生植株的受体系统 研究显示 采
6、用叶片 幼茎 子叶 胚轴以及一些营养变态器官为外植体时 在适宜的培养技术控制下 均可直接分化出芽 特点获得再生植株周期短 操作简单 体细胞无性系变异相对较小 可较好的维持受体植株的遗传特性 转化的外源基因能稳定遗传 特别是茎尖 同样可能出现较多的嵌合体 外植体直接分化出芽较难 转化细胞直接分化成植株难度更大 注意问题直接分化受体系统比较适合于无性繁殖植物选材 从组织类型上讲 子叶 叶片 胚轴和某些营养变态器官通常比较容易诱导 从细胞状态上讲 薄壁细胞状态外植体较容易诱导 原生质体再生系统 原生质体是 裸露 的植物细胞 能直接高效地摄取外源基因 因而转化效率高且合适于现在建立的所有转化方法 原生
7、质体再生系统易于在相对均匀和稳定同等条件下进行准确的转化和鉴定 通过原生质体培养 细胞分裂形成基因型一致的细胞克隆 因此再生植株的嵌合体少 原生质体培养周期长 培养技术限制该系统的应用 特点原生质体受体系统利于准确的转化和鉴定 转化原生质体获得的转基因植株嵌合体少 但由于目前许多植物的原生质培养体系还不成熟 受原生质体培养技术的限制 转化试验的重复性较差 原生质体培养周期长 受体细胞本身的体细胞变异频率高 遗传稳定性差 细胞系及其体细胞胚受体系统 通过筛选和优化的植物细胞悬浮培养的细胞系 通常具有较好的遗传和生理状态的一致性 通过一定的培养基调节 可使细胞进入胚性状态进而形成体细胞胚 该系统培
8、养技术比原生质体容易 转化效率又优于其他组织培养系统 因此被认为是最理想的基因转化受体系统 特点 胚性细胞繁殖量大 同步性好 是理想的基因转化感受态细胞 转化效率高 转化获得的转基因植株嵌合体少 体细胞胚具有两极性 减少了不定芽发育途径中的生根培养过程 获得的后代个体间遗传背景一致 无性系变异小 生殖细胞受体系统 生殖细胞受体系统指的是以生殖细胞如花粉粒和卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统 也叫种质系统 两条途径 利用小孢子和卵细胞的单倍体培养 诱导出胚性细胞或愈伤组织 建立单倍体的基因转化受体系统 直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化 特点具有更强的接受外源DNA的潜能 转化的基因无显隐
9、性的影响 利于性状的选育 加倍后可迅速获得纯合二倍体新品种 花粉管通道法将现代的分子育种与常规育种紧密结合 是十分有潜力的受体系统 在花粉或小孢子培养技术成熟的植物种类中 利用花粉或小孢子培养系统作为受体系统更为理想 建立一个好的受体系统是实现基因转化的先决条件 受体系统的建立主要依赖于植物组织培养技术 而且要求比一般的组织培养技术要高 第三节植物基因转化受体系统的建立 植物基因转化受体系统的建立 外植体具有诱导callus和再生植株的能力 芽的分化率高 易培养 体细胞无性系变异小 对农杆菌介导的基因转化系统而言 高频再生系统必须满足4个条件 外植体的组织细胞具有诱导愈伤组织和再生完整植株的能
10、力 并且最好是外植体能直接分化出芽芽的分化率要高 易于离体培养 具有高度可重复性 体细胞无性系变异小 一 高频再生系统的建立 外植体的选择外植体生理年龄外植体细胞生理状态外植体的遗传背景外植体的选择与受体系统相匹配 培养基选择 植物的营养特性激素的选择 高频再生系统的建立 MS培养基它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的 特点是无机盐和离子浓度较高 为较稳定的平衡溶液 其养分的数量和比例较合适 可满足植物的营养和生理需要 它的硝酸盐含量较其他培养基为高 广泛地用于植物的器官 花药 细胞和原生质体培养 效果良好 有些培养基是由它演变而来的 B5培养基是1968年由G
11、almborg等为培养大豆根细胞而设计的 其主要特点是含有较低的铵 这可能对不少培养物的生长有抑制作用 从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜 如双子叶植物特别是木本植物 目前国际上流行的培养基及特点 White培养基是1943年由White为培养番茄根尖而设计的 1963年又作了改良 称作White改良培养基 提高了MsSO4的浓度和增加了硼素 其特点是无机机盐数量较低 适于生根培养 N6培养基是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的 其特点是成分较简单 KNO3和 NH4 2SO4含量高 在国内已广泛应用于小麦 水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养 KM 8P培养基它是
12、1974年为原生质体培养而设计的 其特点是有机成分较复杂 它包括了所有的单糖和维生素 广泛用于原生质融合的培养 激素 细胞分裂素赤霉素 GA 生长素 促进细胞分裂和分化不定芽6 BA KT ZA 2iP 诱导细胞的分裂和根的分化 IBA 吲哚丁酸 IAA 吲哚乙酸 NAA 2 4 D 诱导生根 2 4 D诱导愈伤组织 抑制愈伤组织形成 促进芽的形成GA3 激素配比模式 生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向 是愈伤组织 长根还是长芽 如为了促进芽器官的分化 应除去或降低生长素的浓度 或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例 生长调节物质的使用甚微 一般用mg L表示浓度 在组织培养中生长调节
13、物质的使用浓度 因植物的种类 部位 时期 内源激素等的不同而异 一般生长素浓度的使用为0 05 5mg L 细胞分裂素0 05 10mg L 培养所需环境条件光照强度 一般而言 愈伤组织的形成并不需要光照 培养前期1000 4000lx 后期10000lx 光照时数 不同培养的组织其光照时间不同 如烟草愈伤组织采用1000lx16小时 日培养 而花椰菜组织培养则以4000lx9小时 日光照为宜光质 一般采用日光灯作为光源 组织培养中关键的器官形成作用 是种光形态发生现象 是受光敏色素控制的 温度 一般习惯将培养物置于恒温下 通常应用的温度为25OC左右 光 受体系统建立时 需要对相关的抗生素种
14、类及其浓度进行试验筛选 抗生素敏感性试验 抑制农杆菌生长的抗生素种类和浓度的筛选要考虑植物种类和农杆菌株系两个方面对植物细胞无毒 不显著抑制植物细胞生长浓度以能够抑制农杆菌生长而不妨碍植物生长的浓度为宜用于转化子筛选的抗生素浓度的确定 二 抗生素敏感性 抗生素敏感性测定 设计出愈伤组织诱导或分化再生培养基 高压灭菌后加入不同种类 不同浓度梯度的无菌抗生素 再将未经转化的受体材料至于选择培养基上培养 观察该抗生素对其分化再生的影响 以及未附加抗生素的培养基接种同样的受体材料未对照来确定适宜的抗生素及浓度 农杆菌的敏感性试验及菌种的选择 农杆菌载体转化是目前植物最成功的转化系统 一般在进行转化前
15、首先需要进行菌株的接瘤或发根试验 选择侵染敏感的农杆菌种类 农杆菌敏感性试验的原理是利用野生型农杆菌能在外植体组织中形成肿瘤或发根 根据肿瘤的诱导率 发生时间及生长状态的敏感程度 其操作程序是把常用的菌株接种在固体琼脂平板或液体培养基中 用牙签挑取菌体 穿刺受体植物组织 可在同一植株的不同部位 叶片及其中脉 花 茎和幼茎的节间多次接种 比较其敏感性 然后将植株在光下几周后观察肿瘤或发根的诱发情况 能形成肿瘤或发根 则说明该植物材料可作为农杆菌的一个宿主 可用农杆菌介导转化 受体系统常见的问题及其解决途径 再生能力及其遗传稳定性褐化玻璃化 再生能力及其遗传稳定性 再生能力下降的解决途径 减少筛选
16、继代次数 选用合适的外植体 采用最适培养基 减少变异性的措施 减少组织培养时间 甚至完全取消组织培养过程 比如用基因枪轰击胚轴或芽的分生组织 收获种子 在后代中筛选转化植株 初代培养外植体的褐变外植体褐变是指在接种后 其表面开始褐变 有时甚至会使整个培养基褐变的现象 它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活 而使细胞的代谢发生变化所致 在褐变过程中 会产生醌类物质 它们多呈棕褐色 当扩散到培养基后 就会抑制其他酶的活性 从而影响所接种外植体的培养 褐化 防止褐变的措施 选择适宜的外植体 缩短转瓶时间 在培养基中添加抗氧化剂 如 Vc 聚乙烯吡咯烷酮 柠檬酸 硫代硫酸钠 二硫苏糖醇 谷光甘肽等 在培养基中添加吸附剂 如0 01 0 1 活性炭 减轻褐变现象发生的方法 选择合适的外植体一般来说 最好选择生长处于旺盛的外植体 这样可以使褐变现象明显减轻 合适的培养条件无机盐成分 植物生长物质水平 适宜温度 及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象 在培养基中加入抗氧化剂在培养基中 使用半胱氨酸 抗坏血酸 PVP等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象 另外 使用0 1 0 5 的
