《生物大分子分离纯化基本原理和技术应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物大分子分离纯化基本原理和技术应用（114页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、生物大分子分离纯化 原理与技术 内容提要 1 层析原理与技术2 凝胶过滤层析3 UNOsphere离子交换分离技术4 CHT陶瓷羟基磷灰石分离技术5 疏水相互作用与亲和层析 Lifeisbasedonproteinsandtheirinteractions 层析原理与操作 层析的起源和原理 起源 1906年 俄国植物学家Tsweet原理 利用物质分配系数不同达到分离目的 原理与操作 Chromatography 层析 色谱 什么是生物层析 根据生物分子物理化学特性的不同而达到分离极性 polarity solubility volatility HIC RP离子特性 ioniccharacte
2、ristics charge IEX大小与形状 size mass diffusion sedimentation GF结构特征与活性位点 shape ligandbinding affinity AC这些特性的区别使不同蛋白质分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离 原理与操作 GelFiltration凝胶过滤 IonExchange离子交换 HydrophobicInteraction疏水层析反相 Affinity亲和层析 CHT羟基磷灰石 原理与操作 最广泛的蛋白质分离纯化方法条件温和维持蛋白质空间结构与活性基于蛋白质对固定相的不同保留达到分离蛋白质溶于流动相中 经过装填固定相的
3、柱子分离 层析原理与操作 层析的5个操作步骤 装柱并平衡上样平衡洗脱再生 上样 装填有层析介质的层析柱 分离 分离组分流出 原理与操作 层析图 原理与操作 第一峰 外水体积 Vo 不与柱中填料相互作用直接从柱中流出 这是样品中的未结合物质 Vo Ve Vt 蛋白质含量 A280 由UV检测器读出 y轴 基线 洗脱峰 有些可以很好的分离 有些分得不是很好 有部分交叉 有时这里也显示梯度浓度等检测值 时间或体积 x轴 纯化平台的硬件结构 层析工作站层析介质和层析柱 原理与操作 层析系统 DuoFlow中高压层析系统 LP低压层析系统 Profinia全自动亲和层析系统 手动层析组件 DuoFlow
4、中高压层析系统 主要特点 3500psi高压力下梯度模式最大流速可达20ml min连续波长 4波长同步检测方形X Y轴组分收集器软件直观容易使用 BioLogicLP低压层析系统 LPDataView软件 BioLogicLP系统 BioFrac方形组分收集器 主要特点 流速精确 0 01ml min检测灵敏度更高 0 001AU兼容方形收集器 Profinia蛋白质纯化系统 主要特点 全自动亲和纯化 包括亲和标签 亲和无标签 抗体等纯化双紫外检测器设计纯化与脱盐串联一步完成结果直接报告目标蛋白的浓度和得率 为什么在层析技术中要使用层析仪 介质的要求实验的精密度和重现性要求时间的要求 纯化平
5、台的硬件结构 层析介质与层析柱 原理与技术 层析介质 离子交换层析介质UnosphereQ SMacroPrepHighQ HighS DEAE CM亲和层析ProfinityIMAC金属螯合介质ProfinityEpoxide环氧亲和介质Affi GelProteinA Affi PrepProteinAAffi Gel蓝胶 DEAE蓝胶 CM蓝胶Affi Prep多粘菌素介质Affi Gel硼胶Affi Gel配体固定化活化介质 凝胶过滤层析介质Bio GelP系列Bio BeadsS X介质羟基磷灰石介质 CHT 氟代羟基磷灰石介质 CFT 疏水层析介质Macro PrepMethylH
6、ICMacro Prept ButylHICBio BeadsSM 2吸附剂 层析柱 分析柱离子交换分析柱 UnoQ SAminex分析柱 分析单糖 寡糖 有机酸 有机碱 以及肽和核酸有机小分子羟基磷灰石分析柱 Bio ScaleCHT I凝胶过滤分析柱 Bio Sil Bio SilectHPLC分析柱反相层析分析柱 Hi PoreRP304 Hi PoreRP318 各种层析介质的Cartridges 用于条件摸索UNOsphereMacroPrepCHTHIC 层析介质结构原理 UnosphereMacroPrep 离子交换层析Q S DEAE CM 疏水层析 CH3 t Butyl 亲
7、和层析ProteinAIDA Ni多粘菌素 凝胶过滤CHT和CFT UnosphereQ SMacroPrepHighQ SMacroPrepDEAE CM MacroPrepMethylHICMacroPrept ButylHIC ProfinityIMACProfinityEpoxideAffi GelProteinA Affi PrepProteinAAffi Gel DEAE CMAffi PrepPolymixinAffi Gel硼胶Affi Gel配体固定化活化 层析介质及其技术 凝胶过滤层析离子交换层析羟基磷灰石层析疏水层析亲和层析 1 Sphericalparticlespac
8、kedintoacolumn 2 Sampleapplied 3 Buffermobilephaseandsamplemovethroughcolumn moleculesdiffuseinandoutofmatrix 4 largemoleculesleavethecolumnfirstfollowedbysmallermoleculesinorderofsize moleculeslargerthanthematrixporespassstraightthrough 凝胶过滤 凝胶过滤层析 分离纯化原理 Agoodgelforgelfiltrationcontainsabout95 wat
9、er 凝胶结构 Stericexclusionleadstoearlyelution 按照分子量大小洗脱大分子首先洗脱 最小的分子在最后面洗脱 1001 00010 000100 000Bio GelP2Bio GelP4Bio GelP6Bio GelP10Bio GelP30Bio GelP60Bio GelP100 1 800 800 4 000 1 000 6 000 用于脱盐 1 500 20 000 2 500 40 000 3 000 60 000 5 000 100 000 100 凝胶过滤层析 凝胶的选择 Bio GelP4 800 4 000 forseparationdi
10、gestedproductsfromIgG 凝胶过滤层析 凝胶的选择 凝胶过滤层析 Bio GelP6 1000 6000 凝胶的选择 凝胶过滤层析 Bio GelP10 1500 20 000 凝胶的选择 凝胶过滤层析 Bio ScaleMiniBio GelP6脱盐预装柱 操作方便 可连接在DuoFlow LP Profinia和Econo泵上 Bio BeadsS X介质 多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体 Bio BeadsS X1 Bio BeadsS X3 600 Bio BeadsS X8 1 000 Bio BeadsS X12 400 高分辨率亲脂性分子排阻色谱 2 000 14 0
11、00 中草药和天然产物活性成分分离纯化高分辨率 快速纯化酯类 芳香族 多环 杂环化合物 介质可兼容苯 甲苯 二甲苯 四氯化碳 二甲基甲酰胺 酮 二氯甲烷 二氯代苯 全氯乙烯等有机溶剂 凝胶过滤层析 1 三硬脂酸甘油酯 8912 三肉豆蔻酸甘油酯 7293 三月桂酸甘油酯 6454 三辛酸甘油酯 4775 三己酸甘油酯 3936 十六烷 2267 十一烷 156 Bio BeadsS X8分离效果 高分辨率亲脂性分子排阻色谱 Bio BeadsS X介质 凝胶过滤层析 柱长的选择分离 30 120cm脱盐 30cm以下洗脱液离子强度 pH 中性流速 根据层析介质的说明 一般很低样品容量 1 3
12、CV 凝胶过滤层析 操作参数选择 增加分辨率的方法 检测柱效检测分离度减少上样体积降低流速使用更小的介质颗粒的介质连接2根层析柱 1 可分离相对分子量从几百到几十万的物质具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开 6000个理论塔板的可将分子量相差1 5倍的蛋白质完全分开 建议柱高在80 120cm 直径 H 302 脱盐 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析的应用 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析的特点 层析柱规模很大 实验室1 0 2 5 30 100cm 工艺10 20 200cm 从而设备成本很高 上样体积少 必须少于柱床体积的3 才能达到较好的分离效果 如果大体积样品必须浓缩
13、 从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性 工艺时间 生产周期 长 甚至24小时或以上 分辨率低 不需摸索纯化条件 按照分子量区带分离 因此 往往用分子筛分离时只适用于纯化的最后一步去热原 或离子交换上样前的脱盐 离子交换层析 离子交换层析类型及其选择 O CH2CH2 NH C2H5 C2H5 N CH3 3 O CH2 C O O SO3 pI stabilityrange stabilityrange 与阳离子交换介质结合 denaturation denaturation pH 10 2 离子交换层析 离子交换层析原理 蛋白质滴定曲线 蛋白质净电荷 与阴离子交换介质结合 Products
14、UNOsphere Q S Macro Prep HighQ S CM DEAE AG resins Equilibration SampleApplication SampleAdsorption Elution Regeneration 离子交换层析 离子交换层析原理 sampleapplicationandwash elution equilibration regeneration anionexchangerbead 离子交换过程 离子强度洗脱时多采用离子浓度梯度 常加NaCl KCl LiCl等 在不同盐浓度 离子强度 及其不同变化率 梯度 条件下保留行为不同 需对该条件进行摸索
15、一般的 随离子强度增加 蛋白质保留值减小 缓冲液与pH选择适当的缓冲体系 起始浓度要尽可能低些 0 01 0 05M 缓冲液PH值 阳离子低于pI一个pH单位以上阴离子通常高于pI一个pH单位以上蛋白质在不同pH下保留行为差别较大 所以许对缓冲体系和操作pH进行摸索 以得到最佳层析条件 离子交换层析 离子交换层析操作参数选择 pI 5 5 pH 10 2 离子交换层析 缓冲液与pH pI 7 5 阳离子交换 阴离子交换 碱性蛋白 采用阳离子交换 酸性蛋白 采用阴离子交换 蛋白质净电荷 pH4 0 pH9 0 蛋白质稳定性范围 pH7 0 pH8 0 pH8 9 pH6 0 缓冲液与pH的影响
16、阴离子交换 离子交换层析 离子交换层析操作参数选择 离子交换层析 离子交换层析操作参数选择 盐溶液梯度的影响 ColumnsMediaBio ScaleMiniHighQMacro PrephighQBio ScaleMiniHighDEAEMacro PrepDEAEBio ScaleMiniHighSMacro PrephighSBio ScaleMiniUNOsphereQMacro PrepCMBio ScaleMiniUNOsphereSMacro Prep25QBio ScaleMiniUNOsphererapidSMacro Prep25SUNOQUNOsphereQUNOSUNOsphereSUNOsphererapidS 离子交换层析 离子交换层析产品 50um 25um 120um 80um 10um 100um 更高的选择性和分辨率10 穿透载量 UnosphereQ 150mg mlBSA 600cm hrUnosphereS 30mg mlBIgG 600cm hr高流速 低反压 操作压力 1week长期 Storagein0 1MNaOH RTfor 1ye
