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1、生 物 化 学 第二章蛋白质 一 概述 二 蛋白质的基本结构单位 氨基酸 三 蛋白质一级结构与功能 目录 四 蛋白质的空间结构与功能 五 蛋白质理化性质 六 蛋白质的分离纯化 1 蛋白质概念 2 蛋白质化学组成 3 蛋白质分类 概 述 一一 一 概述 1 蛋白质概念 protein 是所有生物中普遍存在的 由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子 是非常重要的 结构分子和功能分子 几乎所有的生命现象和生物功能都是蛋白质作用的结果 是生命活动的 体现者 一 概述 一 概述 2 蛋白质化学组成 主 要 微 量 C H O N 少量S P Fe Cu Mn Zn Mg Mo I等 元素组成 一 概述
2、 请思考 有5g植物种子 经测定含氮 0 06g 问该种子蛋白质含量是多少 蛋白质平均含N量为16 这是凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据 粗蛋白质 N 6 25 蛋白质换算系数 100 16 6 25 奶粉三聚氰胺 事件 2004年安徽阜阳出现著名的 大头婴儿 事件 因为长期 食用含有三聚氰胺 假蛋白质 的劣质奶粉 导致营养不良 2008年事件 起因是很多食用某奶粉厂商生产的婴幼儿奶粉的婴 儿被发现患有肾结石 随后在其奶粉中发现化工原料三聚氰胺 三聚氰胺含氮量为66 6 是鲜牛奶 的151倍 是奶粉的23倍 一 概述 化合物组成 一 概述 单纯蛋白质 其完全水解产物只有 氨基酸 结合蛋白质 由
3、单纯蛋白与其它非蛋白成分结合 辅基 而成 一 概述 氨基酸 20种基本氨基酸 无机离子 如磷酸基 Fe2 Cu2 Ca2 等 有机化合物 如核酸 脂类 糖类 血红素 黄素核苷酸 FAD或FMN 等 辅基 一 概述 3 蛋白质的分类 结合蛋白 简单蛋白质 单纯蛋白 组成 分子形状 球状蛋白质 纤维状蛋白质 一 概述 功能 具有保护与支持作用 如胶原 角蛋白 弹性蛋白等 非活性蛋白 活性蛋白 一切有生理活性的蛋白质或它们的前体 一 概述 单纯蛋白质 简单蛋白 完全由氨基酸组成 按溶解度又可分为7类 2 球蛋白 globulin 微溶于水 溶于稀盐溶液 3 谷蛋白 glutelin 溶于稀酸 稀碱
4、4 谷醇溶蛋白 prolamine 溶于70 80 乙醇 5 组蛋白 histone 溶于水 稀酸和稀氨水 6精蛋白 protamine 溶于水和稀酸 不溶于氨水 7 硬蛋白 scleroprotein 不溶于水 盐 稀酸碱 1清蛋白 albumin 溶于水 一 概述 结合蛋白 由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成 按辅基种类分为 2 脂蛋白 lipoprotein 脂质 3糖蛋白 glycoprotein 糖 4磷蛋白 phosphoprotein 磷酸基 5 血红素蛋白 hemoprotein 血红素 6黄素蛋白 flavoprotein FAD 7金属蛋白 metallaprotein 金
5、属 1核蛋白 nucleoprotein 核酸 按生物功能分 一 概述 1 酶 enzyme 2 调节蛋白 regulatory protein 3 转运蛋白 transport protein 4储存蛋白 nutrient and storage protein 5 收缩和运动蛋白 contractile and motile protein 6 结构蛋白 structural protein 7 防御蛋白 defense protein 8 异常蛋白 exotic protein 1 蛋白质的水解 2 氨基酸的结构与分类 3 氨基酸的理化性质 氨基酸 二 一 蛋白质水解 完全水解得到各种氨
6、基酸的混合物 部分水解通常得到肽片段及氨基酸的混合物 氨基酸是蛋白质的基本结构单元 大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成 这20种 氨基酸被称为基本氨基酸 一 蛋白质水解一 蛋白质水解 蛋白质多肽寡肽二肽氨基酸 amino acid aa 或或AA 一 蛋白质水解 酸水解酸水解酸水解 碱水解酶水解 常用6 mol L的盐酸或4 mol L的硫酸在105 110 条件下进行水 解 反应时间约20小时 优点 保持各种L 型氨基酸分子的立体结构不变 缺点 色氨酸被破坏 天冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水 解成了羧基 含有羟基或巯基的氨基酸 丝氨酸 苏氨 酸 半胱氨酸 有一小部分被分解 酸水解 一 蛋
7、白质水解 一般用5 mol L氢氧化钠煮沸10 20小时 优点 色氨酸在水解中不受破坏 缺点 氨基酸普遍发生消旋作用 多数氨基酸都受到不同程度的 破坏 碱水解 一 蛋白质水解 目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶 蛋白酶 已有 十多种 酶水解不会破坏氨基酸 也不会发生消旋作用 酸或碱能够将多肽完全水解 酶水解一般是部分水解 水解的产物为较小的肽段 水解位点特异 用于一级结构分析 或生产部分水解蛋 白质制品 一 蛋白质水解 酶水解 氨基酸是具有氨基 NH3 或亚氨基和羧基 COOH 的有机分 子 氨基酸种类多 但构成蛋白质具有遗传密码的氨基酸只有20种 这20种基本氨基酸称常见氨基酸 二 氨基酸的
8、结构与分类 结构通式 H2NCH COOH R H3NCH COO R 不带电形式 带电形式 不变部分 L 构型 可变部分 二 氨基酸的结构与分类 L 甘油醛 甘油醛 L 氨基酸氨基酸 H CH2OH C CHO HO COOH H2NH R C 天然蛋白质中的 氨基酸都是L型 结构结构 二 氨基酸的结构与分类 二 氨基酸的结构与分类 基本氨基酸中 除脯氨酸外其余均属于L 氨基酸 例外 Gly 没有手性 H3NCH COO R 构型与旋光方向没有直接对应关系 L 氨基酸有的为左旋 有的为右旋 即使同一种L 氨基酸 在不同溶剂也会有不同的旋光度或不同的旋光方向 二十种常见蛋白质氨基酸的分类 结构
9、及三字符号 据R基团化学 结构分类 脂肪族 A 烃链 含羟基或巯基 羧基 碱性基团 芳香族 A Phe Tyr Trp 杂环 His Pro 据R基团 极性分类 极性R基团AA 非极性R基团AA 不带电荷 带电荷 正电荷 种 负电荷 种 二十种常见蛋白质氨基酸的分类 结构及三字符号 据营养学 分类 必需 非必需 据氨基 羧基数分 类 一氨基一羧基 一氨基二羧基 Glu Asp 二氨基一羧基 Lys His Arg Val Trp Lys Met Ile Leu Phe Thr 甘氨酸 Gly G 丙氨酸 Ala A 缬氨酸 Val V 亮氨酸 Lue L 异亮氨酸 Ile I 侧链只是烃链 5
10、种 侧链含羟基或硫原子 4种 丝氨酸 Ser S 苏氨酸 Thr T 半胱氨酸 Cys C 甲硫氨酸 Met M 侧链含有羧基或酰胺基 4种 天冬氨酸 Asp D 谷氨酸 Glu E 天冬酰胺 Asn N 谷氨酰胺 Gln Q 侧链含有碱性基团 3种 赖氨酸 Lys K 精氨酸 Arg R 组氨酸 His H 咪唑环 杂环氨基酸 组氨酸 His H 脯氨酸 Pro P 芳香族氨基酸 苯丙氨酸 Phe F 酪氨酸 Tyr Y 色氨酸 Trp W 1 蛋白质的水解 2 氨基酸的结构与分类 3 氨基酸的理化性质 氨基酸 二 三 氨基酸的理化性质 一般物理性质 两性解离和等电点 重要化学反应 氨基参加
11、的反应 羧基参加的反应 氨基和 羧基共同参加的反应 个别R基团的反应 1 一般物理性质 除甘氨酸外 都有旋光性和比旋光度 有光学活 性 为无色结晶 熔点极高 一般在200 300 各种氨基酸在水中溶解度差别大 能溶于稀酸 稀碱溶液 但不溶于有机溶剂 光吸收 常见氨基酸对可见光无吸收能力 组成蛋白质的氨基酸中色氨酸 Trp 酪氨酸 Tyr 和苯丙氨酸 Phe 的R基团中 含有苯环共轭双键系统 在近紫外光区 220 300nm 显示特征的吸收谱带 最大光吸收 max 分别为280 275 和259nm 由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸 残基 可用紫外分光光度法测定蛋白质 含量 1 一般物理性质 两
12、性离子 氨基酸是两性电解质或两性化合物 碱 的 作 用 酸 的 作 用 COO NH3 R CH COO R CHNH2 H R CHH3N COO 2 两性解离及等电点 A A 等电点 使氨基酸分子所带正负电荷相等 净电荷为零的环境pH 用pI表示 pH pI pH pI pH pI pH pI时 氨基酸带负电荷 向正极移动 pH pI时 氨基酸净电荷为零 pH pI时 氨基酸带负电荷 向正极移动 pH pI时 氨基酸净电荷为零 pH pI时 氨基酸带负电荷 向正极移动 pH pI时 氨基酸净电荷为零 pH 97 以上 B 测定蛋白质的相对分子质量 确定AA数量 一 蛋白质分子的一级结构 通
13、过将相对分子质量除以110 我们可能计算出一个不含其 他化学基团的简单蛋白质的约略氨基酸残基数 虽然20种氨 基酸的平均相对分子质量是138 但大多数蛋白质中小相对 分子质量氨基酸占多数 如果我们将蛋白质各种氨基酸的比 例考虑进去 平均相对分子质量接近于128 又由于形成肽键 时失去一分子水 M 18 蛋白质中氨基酸残基的平均相 对分子质量约为128 相同的18 110 测定蛋白质多肽链种 类和数目 测定蛋白质多肽链种 类和数目 拆分蛋白质分子的多 肽链 拆分蛋白质分子的多 肽链 断开多肽链内的二硫 桥 断开多肽链内的二硫 桥 分析每一条多肽链的 氨基酸组成 分析每一条多肽链的 氨基酸组成 鉴
14、定多肽链的N 末端 和C 末端残基 鉴定多肽链的N 末端 和C 末端残基 用两种或几种不同的 断裂方法将多肽链裂 解成较小的片段 用两种或几种不同的 断裂方法将多肽链裂 解成较小的片段 测定各肽段的氨基酸 序列 测定各肽段的氨基酸 序列 重建完整多肽链的氨 基酸序列 重建完整多肽链的氨 基酸序列 确定半胱氨酸残基间 形成的二硫键的位置 确定半胱氨酸残基间 形成的二硫键的位置 一级结构测定的基本流程 1 测定蛋白质多肽链种类和数目 数目 N末端氨基酸残基摩尔数 蛋白质摩尔数 2 拆分蛋白质分子的多肽链 拆分非共价键 变性剂 8mol L的尿素或6mol L的盐酸胍 拆分二硫键 S S 断裂 巯基
15、乙醇和碘乙酸 3 断开多肽链内的二硫桥 4 分析每一条多肽链的氨基酸组成 完全水解 酸水解 一级结构测定的基本流程 羧肽酶A 水解除 Pro Arg Lys之外所 有C 末端 羧肽酶B 只水解 Arg Lys为C 末端残 基的肽键 5 鉴定多肽链的N 末端和C 末端残基 N 末端 Sanger试剂 Edman试剂 氨肽 酶法 C 末端 肼解法 还原法 羧肽酶法 一级结构测定的基本流程 6 裂解成较小的片段 酶裂解法 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 胃蛋白酶等 化学裂解法 得到肽段较大 溴化氰 CNBr 只断裂Met羧基参加形成的肽键 羟胺 NH2OH 断裂Asn Gly肽键 一级结构测定的基本流程 只
16、断裂Lys或Arg残基的羧基参与形成的肽键 但 若Lys Arg的羧基与Pro相连 该酶不能作用 糜蛋白酶 断裂Phe Trp和Tyr等疏水氨基酸残基 的羧基端肽键 但若与它们的羧基相连的是Pro 该酶不能水解 胰蛋白酶 胰凝乳 蛋白酶 一级结构测定的基本流程 举例 几种蛋白水解酶 内肽酶 的专一性 断裂点两侧的残基都是疏水性氨基酸 如 Phe Phe Glu蛋白酶 在磷酸缓冲液 pH7 8 中时 能从Glu和Asp残基 的羧基端断裂肽键 在碳酸氢铵缓冲液 pH7 8 或醋酸铵缓冲液 pH4 0 时 只断裂Glu残基羧基端的肽键 胃蛋白酶 葡萄球菌 蛋白酶 专门裂解Arg羧基端肽键 梭菌 蛋白酶 一级结构测定的基本流程 7 测定各肽段的氨基酸序列 Edman降解法 质谱法 MS 等 8 利用重叠肽段推断 重建 完整多肽链的氨基酸序列 一级结构测定的基本流程 9 二硫桥位置的确定 对角线电泳 一般采用胃蛋白酶处理原来的含二硫键的多肽链 利用双 向电泳 对角线电泳 技术 分别对用过甲酸处理前 后的肽 段进行电泳 分离出各个肽段 将每个肽段进行组成及顺序分 析 然后同其它方法分析的肽段进行比
