《噬菌体裂解液的制备、噬菌体效价测定及转导》由会员分享，可在线阅读，更多相关《噬菌体裂解液的制备、噬菌体效价测定及转导（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、噬菌体裂解液的制备、噬菌体效价测定及转导实验原理：溶原性细菌经紫外线照射诱导后，使得原噬菌体从细菌染色体上脱离而进入裂解周期，在宿主细菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。细菌被裂解，释放出游离的噬菌体粒子，通过离心获得噬菌体裂解液。噬菌体的效价是指 1ml 噬菌体裂解液中所含噬菌体的数目。在含有敏感宿主菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，根据噬菌斑形成单位，进行噬菌体效价测定。转导分为两种类型，即为普遍性转导和局限性转导。本实验为局限性转导，以双重溶源性细菌 E.coli K12F()gal+为供体，经紫外线（UV）诱导，在噬菌体裂解液中，将含有两种类型的噬菌体， （ 和
2、 dg） ，dg 是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因（gal ） ，当缺陷性噬菌体 dg 再次侵染敏感菌大肠杆菌 K12S 时，会将发酵半乳糖的基因转移到 S 菌，使 S 菌获得 gal 基因，从而使得 S 菌获得发酵半乳糖的能力，利用转导子在 EMB 培养基上发酵半乳糖的特征进行转导频率的计算和分析。实验材料和方法：材料：菌种：E. coli K12 F，E. coli K12S，各种方式保藏的微生物菌种，噬菌体裂解液培养基：牛肉膏蛋白胨固体及液体培养基，素琼脂，EMB 培养基试剂：氯仿、 磷酸缓冲液，无菌水，1%琼脂糖仪器：离心机、UV 灯、磁力搅拌器，培养箱，打孔器等实
3、验方法：1、噬菌体裂解液的制备从 E. coli K12 F 菌种斜面上取一环菌种，接种于 2mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，离心 10min，弃去上清夜，用等体积磷酸缓冲液悬浮细胞，制成菌悬液。将菌悬液加至带有搅拌子的小培养皿中，并将培养皿置于紫外灯下方的磁力搅拌器上，先照射 1min 后打开皿盖，同时打开搅拌器开关，用紫外线准确照射 13s 后马上盖上皿盖。处理后加入 2mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基，37条件下恒温避光培养 2h。取上述已避光培养的培养液 4mL，加至无菌离心管中，然后加入 0.2mL 氯仿，振荡，静置 5min 后离心 10min。并将上清液吸入新的无菌试管中，在 4冰箱
4、中冷冻备用。2、噬菌体效价的测定将噬菌体裂解液活化后，取 0.5mL，用 4.5mL/管的牛肉膏蛋白胨液体培养基进行 10倍系列稀释至稀释到原液的 10-4。将素琼脂培养基融化后向每个试管中加入 4mL50的素琼脂液体，并向每支试管中加入 0.5mL E. coli K12S，振荡使之混合均匀，再分别取 10-2、10 -3、 10-4 三个稀释度的噬菌体菌悬液 0.5mL 介入素琼脂试管中。前后揉搓，使之混匀，立即倒在含有牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上。倒置与 37恒温培养箱中培养 24h。噬菌体效价计算方法：噬菌体效价/菌体数mL-1=2m5.0L稀 释 倍 数每 平 皿 平 均 噬 菌
5、斑 数3、细菌转导点滴法：倒 EMB 平板，并如图所示在平板上做好标记，在培养基标记相应处接种相应不同菌种或噬菌体裂解液。结果中能观察倒标记 E. coli K12 F 处长出的菌落为紫色带有金属光泽的菌落，若在 与 E. coli K12S 交界处也长出紫色带有金属光泽的菌落，则表明细菌转导成功；若没出现这样的菌落，则表明细菌转导不成功4、转导频率的测定向一支空试管中加入 0.5mL E. coli K12S，在 37恒温培养箱中培养 10min。用牛肉膏蛋白胨液体培养基将原液稀释至 10-3、10-4 ，每个稀释度用 0.2mL 裂解液涂两个平板，在37恒温箱中培养 48h，观察结果并计算
6、转导频率：转导 子 /=每皿平均 转导 子数 稀 释 度 20.2转导频率=%10m/噬 菌 体 效 价转 导 子 L4实验结果：1、噬菌体效价的测定浓度 噬菌斑数量10-4 (168+172)*2=680噬菌体效价： 680*10000*2=136000002、点滴法F 菌长出，S 菌落长出，F 菌比 S 菌落小，头顶有粉色帽子。在 S 菌与噬菌体裂解液交汇处，发现有异形菌株，形态与 F 菌很像。EMB 平板上标记 的三角形处未见菌落，标记 F 菌处见明显的带金属光泽的深紫色；下图中，实验结果 1 中标记 的两个圆有呈现金属光泽的深紫色，实验结果 2 右侧的圆与 S 菌交界处菌落呈金属光泽。
7、结果说明噬菌体中的 dg 将 E.coli K12F()gal+中发酵半乳糖的基因（gal）导入了 E.coli K12 S gal-使 S 菌的菌落在 EMB 培养基上呈金属光泽。图 1:点滴法细菌转导实验结果3、转导频率的测定稀释度 转导子数 平均数10-4 1976 1584 1780510-4:：转导因子：1780*10000*2/0.2=178000000 转导频率：178000000/480000=1309%分析讨论：噬菌体效价的测定:第一次实验失败，噬菌斑太少，效价不明显。第二次实验结果中是在 10-4 浓度下效价更加显著，而前两个浓度下的效价依然不是很明显。点滴法：实验效果很好，结果说明噬菌体中的 dg 将 E.coli K12F()gal+中发酵半乳糖的基因（gal）导入了 E.coli K12 S gal-使 S 菌的菌落在 EMB 培养基上呈金属光泽。而且呈现金属光泽的菌落数很密集。转导频率的测定：本组实验结果显示转导频率远远超过 1，而理论上这种情况不可能发生，推测原因可能由于培养时间过短，没有数出所有噬菌斑，而噬菌斑的数目应远远大于实验所得结果。
