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1、生物分离工程 细胞分离与破碎 总体学习目的和要求 通过本章学习 要求掌握解细胞分离 和目标产物的释放的原理和方法 熟 知各种方法的优缺点和应用范围 目录 n重力沉降 n离心沉降 n细胞破碎与胞内物释放 细胞分离 学习要点 n识记 重力沉降 离心沉降和过滤的概念 n理解 重力沉降 离心分离与过滤原理 理 论 掌握Stokes沉降公式 n应用 常用离心方法及优缺点 利用掌握的 提高分离效率的方法分析决实际问题 细胞分离 重力沉降定义 重力沉降是传统化工过程中常用的从含有 固体颗粒的流体中将颗粒分离出来的操作 重力沉降是利用流体与颗粒间的密度差 在重力的作用下使颗粒与流体之间产 生相对运动 从而实现
2、两者的分离 在生物分离过程中 定义中颗粒为细胞 细胞碎片等有形物 千姿百态的微生物世界 Bacterial morphology diagram High density cell culture 细胞分离 重力沉降理论 n理论假设 n细胞或细胞碎片按照球形颗粒处理 n颗粒在无限稀释的溶液中进行沉降 颗粒 之间无相互干扰 n受力分析 球形颗粒重力fg 液体的浮力fb 颗粒运动方向相反的阻力 fs 细胞分离 重力沉降理论 重力 浮力 阻力 细胞分离 重力沉降理论 当球形颗粒自身的重力与其所受到浮力和阻力 达到平衡时 则 细胞分离 重力沉降理论 当球形颗粒处于滞流区 时 Stokes公式 当球形颗
3、粒处于过渡区 时 Allen公式 当球形颗粒处于湍流区 时 Newton公式 千姿百态的微生物世界 Bacterial morphology diagramHigh density cell culture 球形颗粒 无限稀释溶液 细胞分离 重力沉降理论 n模型校正 n形态校正 颗粒的形状系数 n速度校正 空隙率函数 n提高重力沉降的途径 n加入中性盐 双电层排斥电位降低 n加入高分子絮凝剂 架桥作用形成大絮凝图 n引入外力 细胞分离 重力沉降理论 n模型校正 形态校正 速度校正 n提高重力沉降的途径 加入中性盐 加入高分子絮凝剂 引入外力 细胞分离 离心沉降定义 离心沉降是利用沉降设备使流体
4、和颗粒旋 转 在离心力的作用下 由于颗粒和流体 间存在密度差 所以颗粒沿径向与流体产 生相对运动 从而使颗粒和流体分离 细胞分离 离心沉降理论 离心沉降速度 令 细胞分离 离心分离方法 n差速离心分级 n区带离心 差速区带离心 平衡区带离心 差速离心分离 差速离心是以菌体细胞的收集或除去为目的 的固液离心分离方法 应用某一特定颗粒沉淀 的离心力在预定的离心时间内得到一部分颗粒 沉淀及包含未沉淀颗粒的上清液 差速离心分离应用实例 600g 10 min 15000g 10 min 100000g 60 min 300000g 120 min nuclei Mitochondria lysosom
5、es Plasma membrane Riosomal subunits homogenate Filtered homogenate Soluble part of cytoplasm Sedimentation 区带离心分离 前提 在离心管内的溶液存在密度梯度 采用 事先配好的不同浓度 密度 的梯度介质 蔗糖等 按照浓度从大到小的原则 依次 层层加入 加入离心管中的梯度介质经高速 离心或静置后可形成连续的密度梯度 操作过程 区带离心种类 n差速区带离心 速度区带离心 n平衡区带离心 等密度离心 差 速 区 带 离 心 差速区带离心 n基于颗粒的大小 形状的分离 n梯度液的最大密度不能超过所
6、分离颗粒的 最大密度 n离心过程中 颗粒不断沉降至其浮力密度 与梯度液密度相等 n动态离心分离方法 平 衡 区 带 离 心 平衡区带离心 n梯度液密度范围含盖全部待分离颗粒密度 n离心过程中 颗粒不断沉降至其浮力密度 与梯度液密度相等 n平衡离心分离方法 梯度液的种类和应用 细胞分离 区带离心异同 区带离心种类差速区带离心平衡区带离心 共同点事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度 梯度介质常用蔗糖常用氯化铯 密度梯度 最大的密度梯度低于最大密 度的沉降样品 最大的密度梯度大于最大密 度的沉降样品 区带形成条件 根据各个组分沉降系数的差 别 形成各自的区带 根据各组分密度差形成区带 离心条件
7、 在最前的沉降物质达到管底 前停止 短时间 低速度 使各组分沉降到其平衡的密 度区 长时间 高速度 细胞分离 离心设备分类 分类方法名称 处理量实验室用离心机 工业用离心机 温度常温离心机 冷冻离心机 转速低速离心机 高速离心机 超速离心机 转子结构管式 碟式 细胞分离 常用离心设备 Solids ejecting disk bowl centrifuge of pilot size for sterilizable contained installation Nozzle machine with pressurized solids discharge for yeast and bac
8、teria separation 细胞分离 常用离心设备 Decanter centrifuge Multichamber bowl vertical cut 细胞分离 管式离心设备 A disposable cell separation insert PowerfugeTM one chamber with scraper 细胞分离 碟片离心设备 a Solids retaining disk bowl b Radial solids ejecting disk bowl top feed c Radial solids ejecting disk bowl hermetic feed d
9、 Axial solids ejecting disk bowl e Nozzle bowl with pressurized solids discharge f Nozzle bowl with peripheral discharge nozzles 细胞分离 离心设备比较 管式离心机 优点结构简单 转速和离心力较大 缺点沉降面积小 处理能力低 碟式离心机 优点转子中存在隔板以增大沉降面积 处理能力大 缺点结构复杂 转速较低 细胞分离 离心机处理能力 粒子在径向上的沉降速度 轴向移动速度 完全沉降的边界条件 细胞分离 离心机处理能力 影响因素 处理样品的特性 如密度 粒径等 溶液的特性
10、如密度 粘度等 离心机机械结构 如r1和r2 操作条件 细胞分离 过滤定义 过滤是利用多孔性介质 如滤布 截留 固液悬浮液中的固体粒子 进行固液分 离的方法 过滤本身是一种膜分离技术 在分离细胞 菌体或 它们的碎片过程中除了沉降分离方法外 过滤技术也是 一种常备的分离方法 细胞分离 过滤过程受力分析 推动力 过滤操作以压力差为主要推动力 阻 力 过滤过程的阻力来自多孔性过滤介 质和介质表面不断堆积形成的滤饼 细胞分离 过滤速率 Rm表示介质的阻力 Rc表示滤饼的阻力 L为滤液的粘度 细胞分离 恒压过滤方程 Ruth恒压过滤方程 其中 K为Ruth恒压过滤系数 表示为 细胞分离 提高过滤速度的途
11、径 n采用絮凝或凝聚的方法预处理改变料液 的性质 降低滤饼阻力 n加入助滤剂以改变滤饼的压缩性指数 提高过滤速度 胞内产物释放 学习要点 n理解 各种细胞破碎方法原理 优缺点 及其适用范围 n应用 采用不同的细胞破碎方法对不同 细胞进行不同程度的破碎 胞内产物释放 细胞结构 真核细胞与原核细胞 动物细胞没有细胞壁 只有由脂质和蛋白质组成的细胞膜 植物细胞细胞膜外有一层坚固的细胞壁 酵母细胞细胞壁由葡聚糖 甘露聚糖和蛋白质构成 更加难以破碎 真核细胞 原核细胞 革兰氏阳性菌细胞壁由肽聚糖层组成 壁厚约15 50 nm 肽聚糖含量为40 90 细胞壁较革兰氏阴性菌坚固 革兰氏阴性菌细胞壁在肽聚糖的
12、外侧还有分别由 1 脂蛋白和 2 磷脂和脂多 糖构成的两层外壁层 外壁层厚度越8 10 nm 胞内产物释放 细胞膜组成 A B 胞内产物释放 影响产物释放的环境因素 在复杂培养基中生长的大肠杆菌细胞其破碎较单 一培养基中生长的大肠杆菌细胞更难 对数生长期的细胞会表现得更加脆弱 从连续培养过程中获得的 具有较高比生长速率 的念珠菌的细胞壁更加脆弱 而摇瓶培养的念珠 菌体则有更加充裕的机会构建更加坚固的细胞壁 酵母细胞壁的厚度和破碎阻力随年龄增长而增加 n经常在幼酵母细胞中出现的芽痕 Bud scars 可引起酵母细胞局部细胞壁强度的降低 胞内产物释放 细胞破碎原理 细胞 破碎 机械破碎高压均浆法
13、 珠磨法 撞击破碎 超声波 破碎 非机械破碎物理法渗透压冲击 冻结 融化 超声波 化学法酸碱处理 化学试剂处理 生物法酶溶 自溶 噬菌体 胞内产物释放 机械破碎之高压匀浆 细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀杆之间的环隙高速 可 达到450 m s 喷出后撞击到碰撞环上 细胞在受到高速撞击作 用后 急剧释放到低压环境 从而在撞击力和剪切力等综合作 用下破碎 胞内产物释放 机械破碎之珠磨 珠磨机的破碎室内填充有80 85 v v 的玻璃 密度为2 5 g ml 或氧化锆 密度为6 0 g ml 的微球 粒径约0 1 1 0 mm 在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动 微球与微球 之间以及微球和细胞之间
14、发生冲击和研磨 使悬浮液中的细 胞受到研磨剪切和撞击而破碎 胞内产物释放 机械破碎之撞击破碎 撞击破碎原理 细胞悬浮液以喷雾状高速冻结 冻结速度为数 千 min 形成粒径小于50 微米的微粒子 高速 载气 如氮气 流速为300m s 将冻结的微粒子送 入破碎室 高速撞击撞击板 使冻结的细胞发生破 碎 胞内产物释放 机械破碎之超声波破碎 压电传感器将电子振荡器的交变电流转换 为声波 在超声波的作用下液体发生空化作用 空穴的形成 增大和闭合产生极大的冲击波 和剪切力 使细胞破碎 胞内产物释放 非机械破碎之 q酸碱处理 q化学试剂处理 q酶溶 q自溶 q渗透压冲击法 q冻结 融化法 胞内产物释放 胞内产物释放模型 细胞破碎速度与未破碎细胞浓度x成正比 从破碎的细胞释放产物的速率与胞内未释放的产物浓度 成正比 模型假设 模型推导
