质粒抽提及检测通则

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1、 ICS 点击此处添加 ICS 号 点击此处添加中国标准文献分类号 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB T XXXXX XXXX 质粒抽提及测定通则 Principle of plasmid extraction and testing 征求意见稿 XXXX XX XX 发布 XXXX XX XX 实施 GB T XXXXX XXXX I 目 次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 原理 1 3 1 抽提 1 3 2 检测 1 4 仪器和设备 1 5 方法 2 5 1 抽提 2 5 2 检测 2 附录 A 规范性附录 质

2、粒 DNA 抽提方法 3 附录 B 规范性附录 质粒 DNA 检测方法 10 GB T XXXXX XXXX II 前 言 本标准按照GB T 1 1 2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会提出并归口 本标准起草单位 本标准主要起草人 GB T XXXXX XXXX 1 质粒抽提和测定通则 1 范围 本标准规定了科研用质粒的抽提方法 以及质粒的超螺旋程度 残余RNA 基因组DNA 浓度 纯度 限制性酶分析 细菌计数等检测方法 本标准适用于科研用质粒的抽提及测定 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件 仅所注日期的版本适用于本文 件

3、凡是不注日期的引用文件 其最新版本 包括所有的修改单 适用于本文件 GB T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB T 30988 2014 多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法 GB T 34265 2017 Sanger法测序技术指南 GB T 19495 1 2004 转基因产品检测 通用要求和定义 GB T 19495 3 2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB T 19495 5 2004 转基因产品检测核酸定量 PCR检测方法 GB T 19495 4 2018 转基因产品检测 实时荧光定性聚合酶链式反应 PCR 检测方法 GB 4789 3 2016 食品安

4、全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数 GB 4789 15 2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数 GB T 19495 8 2004 转基因产品检测 蛋白质检测方法 中国药典2015版 细菌内毒素检查法 中国药典2015版 外源性DNA残留量测定法 中国药典2015版 非无菌产品微生物限度检查 微生物计数法 中国药典2015版 高效液相色谱法 中国药典2015版 紫外 可见分光光度法 中国药典2015版 大肠杆菌菌体蛋白质残留量测定法 3 原理 3 1 抽提 通过裂解大肠杆菌细胞 使得质粒DNA从细胞中释放出来 再弃除质粒DNA中的蛋白等杂质 以及质 粒DNA提取

5、过程中加入的异丙醇 乙醇等有机溶剂 最终得到纯的质粒DNA 3 2 检测 通过质粒浓度 构型 纯度 正确性的测量对质粒进行鉴定 4 仪器和设备 GB T XXXXX XXXX 2 4 1 摇床 工作范围 15 42 4 2 涡旋混合仪 4 3 水浴锅 工作范围 20 90 4 4 高效液相色谱 HPLC 设备 4 5 一代测序仪 4 6 超微量分光光度计 4 7 电泳仪 4 8 凝胶成像系统 4 9 3 730 型测序仪 4 10 PCR 仪 4 11 离心机 可在 4 下进行离心 离心转速达 12000 r min 以上 4 12 金属浴 5 方法 5 1 抽提 见附录A 5 2 检测 见附

6、录B GB T XXXXX XXXX 3 A A 附 录 A 规范性附录 质粒 DNA 抽提方法 A 1 硅胶柱法 A 1 1 范围 参考GB T 19495 3 2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 硅土法提取DNA A 1 2 实验设备 试剂和材料 A 1 2 1 葡萄糖 glucose C6H12O6 A 1 2 2 三羟甲基氨基甲烷 Tris hydroxymethyl methyl aminomethane THAM Tris C4H11NO3 A 1 2 3 盐酸 hydrochloric acid HCI A 1 2 4 乙二胺四乙酸二钠 Ethylenediaminete

7、traacetic acid disodium salt Na2EDTA C10H14N2Na 2O8 A 1 2 5 核糖核酸酶A Rnase A A 1 2 6 氢氧化钠 Sodium hydroxide NaOH A 1 2 7 十二烷基硫酸钠 Sodium dodecyl sulfate SDS C12H25SO4Na A 1 2 8 醋酸钾 potassium acetate CH3COOK A 1 2 9 冰醋酸 AceticAcid CH3COOH A 1 2 10 盐酸胍 Guanidine Hydrochloride Gu HCI CH6ClN3 A 1 2 11 乙醇 et

8、hanol C2H6O A 1 2 12 异丙醇 Isopropanol C3H8O A 1 2 13 2 mL 离心管 A 1 2 14 1 5 mL 离心管 A 1 2 15 二氧化硅质粒吸附柱 A 1 2 16 RNaseA 10 mg mL A 1 2 17 溶液 50 mmol L 葡萄糖 25 mM Tris Cl 10 mM EDTA 100 g mL Rnase A 1 2 18 溶液 200 mM NaOH 1 SDS A 1 2 19 溶液 pH4 2 4 M盐酸胍 0 5 M醋酸钾 A 1 2 20 Buffer W1 20 mM Tris Cl 5 mmol L 盐酸胍

9、 15 异丙醇 GB T XXXXX XXXX 4 A 1 2 21 Buffer W2 20 mM Tris Cl 75 乙醇 A 1 2 22 TE pH8 0 10 mM Tris Cl 1 mM EDTA A 1 2 23 80 乙醇 A 1 2 24 灭菌水 A 1 3 操作步骤 A 1 3 1 收集2 4mL菌液到2 mL离心管中 12000 r min 离心1 min A 1 3 2 弃上清 干燥 A 1 3 3 向离心管中加入250 L 溶液 加入RNase A 涡旋震荡使得细胞重新悬浮 A 1 3 4 向离心管中加入250 L 溶液 裂解Buffer 温和翻转离心管6 10次

10、 使菌体充分裂解 液体变得澄清浓稠 A 1 3 5 向离心管中加入350 L 溶液 温和翻转离心管6 10次 此时可观察到管内出现白色絮状 沉淀 12000 r min室温离心10 min A 1 3 6 将离心后上清移至二氧化硅吸附柱中 12000 r min室温离心1 min 倒掉收集管中的废液 A 1 3 7 向吸附柱中加入500 L Buffer W1 12000 r min离心1 min 倒掉收集管中的废液 A 1 3 8 向吸附柱中加入600 L Buffer W2 加入无水乙醇 12000 r min离心1 min 倒掉收集管中 的废液 A 1 3 9 向吸附柱中再次加入600

11、L Buffer W2 加入无水乙醇 12000 r min离心1 min 倒掉收集 管中的废液 A 1 3 10 将吸附柱和收集管放回离心机中 12000 r min空转离心2 min A 1 3 11 将吸附柱移至新的1 5 mL EP管中 向吸附柱中央的膜上加40 50 L预热灭菌水 静置3 5 min 12000 r min离心2 min 洗脱得到液体质粒DNA A 2 磁珠法 A 2 1 范围 磁珠法抽提质粒DNA适用于高通量质粒抽提需求 A 2 2 实验设备 试剂和材料 A 2 2 1 葡萄糖 glucose C6H12O6 A 2 2 2 三羟甲基氨基甲烷 Tris hydrox

12、ymethyl methyl aminomethane THAM Tris C4H11NO3 A 2 2 3 盐酸 hydrochloric acid HCI A 2 2 4 乙二胺四乙酸二钠 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt Na2EDTA C10H14N2Na 2O8 GB T XXXXX XXXX 5 A 2 2 5 核糖核酸酶A Rnase A A 2 2 6 氢氧化钠 Sodium hydroxide NaOH A 2 2 7 十二烷基硫酸钠 Sodium dodecyl sulfate SDS C12H25SO4Na A 2

13、 2 8 醋酸钾 potassium acetate CH3COOK A 2 2 9 冰醋酸 AceticAcid CH3COOH A 2 2 10 盐酸胍 Guanidine Hydrochloride Gu HCI CH6ClN3 A 2 2 11 乙醇 ethanol C2H6O A 2 2 12 异丙醇 Isopropanol C3H8O A 2 2 13 2 mL 离心管 A 2 2 14 1 5 mL 离心管 A 2 2 15 磁珠悬浮液 内含特异性吸附质粒DNA的磁珠 A 2 2 16 溶液1 pH8 0 50 mmol L 葡萄糖 25 mM Tris Cl 10 mM EDT

14、A 100 g mL Rnase A A 2 2 17 溶液2 200 mM NaOH 1 SDS A 2 2 18 溶液3 pH5 5 3 M 醋酸钾 A 2 2 19 Buffer W2 20 mM Tris Cl 75 乙醇 A 2 2 20 TE pH8 0 10 mM Tris Cl 1 mM EDTA A 2 2 21 80 乙醇 A 2 2 22 RNaseA 10 mg mL A 2 2 23 离心管用磁力架 A 2 3 操作步骤 A 2 3 1 收集2 mL 4 mL 菌液到2 mL离心管中 12000 r min 离心1 min A 2 3 2 弃上清 干燥 A 2 3 3

15、 向离心管中加入250 L 溶液1 加入RNase A 涡旋震荡使得细胞重新悬浮 A 2 3 4 向离心管中加入250 L 溶液2 温和翻转离心管6次 10次 使菌体充分裂解 液体变得澄清 浓稠 A 2 3 5 向离心管中加入350 L 溶液3 温和翻转离心管6次 10次 此时可观察到管内出现白色絮状 沉淀 12000 r min室温离心10 min A 2 3 6 将上清加入新的1 5 mL离心管 再加入15 L的磁珠悬浮液 震荡混匀 放置5 min 如需 高产量 可放置10 min 期间混匀几次 GB T XXXXX XXXX 6 A 2 3 7 把离心管放到磁力架上 静置30 s 磁珠自

16、动被吸附在管壁 吸弃上清 磁珠分离要在磁力 架上完成 A 2 3 8 加入500 L Buffer W2 颠倒混匀 放到磁力架上 静置30 s 吸弃上清 磁珠分离要在磁 力架上完成 A 2 3 9 再次加入500 L Buffer W2 颠倒混匀 放到磁力架上 静置30 s 吸弃上清 磁珠分离要 在磁力架上完成 A 2 3 10 室温放置5 min 确保乙醇挥发干净 加50 L洗脱液 轻轻吹打使磁珠完全悬浮于洗脱液后 于室温静置1 min A 2 3 11 把离心管放到磁力架上 静置30 s 磁珠自动被吸附在管壁 将洗脱液转移到洁净的离心管 中 20 中保存备用 A 3 酚仿提取及异丙醇沉淀法 A 3 1 范围 参考GB T 19495 3 2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法酚 三氯甲烷法提取DNA A 3 2 实验设备 试剂和材料 A 3 2 1 葡萄糖 glucose C6H12O6 A 3 2 2 三羟甲基氨基甲烷 Tris hydroxymethyl methyl aminomethane THAM Tris C4H11NO3 A 3 2 3 盐酸 hydrochlor