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1、第七章 聚合酶链反应及其应用 第一节 聚合酶链反应的原理 第二节 标准的PCR扩增方案及注意事项 第三节 PCR相关技术及应用 第一节 聚合酶链反应的原理 聚合酶链反应 polymerase chain reaction 体外DNA复制 变性 退火 延伸 三步一周期 PCR开始的几个循环 第二节 标准的PCR扩增方案及注意事项 1 反应体系 10 buffer 5 l Mg2 1 5 3mM 4 dNTP 2 5mM 4 l P1 10pmol l 1 l P2 10pmol l 1 l Taq 5U l 0 25 l Template 1 l 质粒 基因组DNA Up to 50 l 2 反
2、应条件 94 5min 94 30s 98 15s 55 45s 35cycle 30s 1min 72 1min 72 7min 2步PCR 4 退火温度根据扩增特异性调整 延伸时间根据扩增片段长度调整 扩增产物通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 3 PCR引物的设计 引物 primer 方向 一个与已知序列一致 另一个与已知序列反向互补 18bp以上 主要原则 3 末端不能明显互补 避免分子内序列自互补 避免同聚寡核苷酸序列及二核苷酸重复序列 亚克隆的引物设计 在引物的5 末端加上适当的限制性内切酶酶切位点 为了保证限制性内切酶对扩增出的DNA片段可有效地进行 酶解 一般在酶切位点的5 端
3、再加上几个额外的碱基 保护碱基 引物Tm值的计算 Tm G C 4 A T 2 退火温度 Tm 5 计算机辅助引物设计 Primer 5 Genetool 4 防止污染 设置严格的对照体系 包括 空白对照 阴性对照 阳性对照 梯度实验 重复实验 扩增植物基因组中 actin基因片段的电泳图 1 3 小麦 4 6 烟草 7 9 玉米 10 12 大豆 M DL2000 E 空白对照 5 如果PCR扩增出现非特异条带 解决方案 包括 a 提高退火温度 b Hot start PCR c Touch down PCR d 重新设计引物 第三节 PCR相关技术及应用 1 反转 PCR技术 RT PCR
4、 mRNA 反转录 cDNA PCR 目的基因 测序 根据已知 同源 序列设计 简并 degenerate 引物 Blast Clustal X 2 随机扩增的多态性DNA技术 Randomly Amplified Polymorphic DNA RAPD 与常规PCR的主要区别 单引物 一般10bp 退火温度 35 37 l限制性片段长度多态性 Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP l应用 DNA多态性分析 遗传图谱制作 分类学研究等 利用RFLP和RAPD对DNA片段进行多态性分析的比较 3 mRNA差示技术 mRNA differen
5、tial display technique mRNA DD PCR 利用mRNA差示技术 mRNA DD PCR 进行基因克隆的图解 4 减法杂交 PCR法 注意 方法2 3 4 不需要任何已知序列 5 免疫PCR 免疫PCR的操作原理 6 反向PCR Inverse PCR 反向PCR的操作原理 7 不对称PCR asymmetric PCR 两个引物的浓度不同 典型的引物浓度比例是50 1或100 1 最初PCR循环中 绝大多数PCR产物是双链并以 指数式积累 当低浓度引物用尽后 单链DNA以 线性方式积累 8 RACE策略 rapid amplification of cDNA end
6、 3 RACE 巢式PCR net PCR 5 RACE 5 RACE 5 RACE RLM RACE RNA ligase mediated 碱性磷酸酶 烟草焦磷酸酶 主要改进 只从全长的 有帽子的mRNA 扩增cDNA 9 定量PCR l平台效应 扩增产物量未必反映起始模板量 竞争PCR competitive PCR 实时定量PCR Real Time PCR 竞争PCR的3点条件 能够与目的DNA共用相同的引物扩增 PCR扩增产物能够与目的DNA相区别 浓度或者量已知 l扩增产物量之比反映其始模板量之比 lcompetitive RT PCR cDNA与DNA competitor mRNA与RNA competitor
