离心机操作及血液处理

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1、实验基础技能培训 李玉涛 2017 07 Part 1 血液基本成分及其分离方法 Part 2 离心机简介及使用 Part 1 血液基本成分及其分离方法 一 血液基本成分 二 血液物理性质 三 血液采集常用方法 四 血液成分分离方法 一 血液基本成分 血细胞形态 数量 比例和血红蛋白含量的测定称为血像 患病时 血像常有显著变化 故检查血像对了解机体状况和诊断疾病十分重要 1 红细胞 红细胞 erythrocyte red blood cell 直径7 8 5 m 呈双凹圆盘状 中央较薄 1 0 m 周缘较厚 2 0 m 红细胞的这种形态使它具有较大的表面积 约140 m2 便于携O2 和部分C

2、O2 成熟红细胞无细胞核 也无细胞器 胞质内充满血红蛋白 hemoglobin Hb 红细胞的渗透压与血浆相等 使出入红细胞的水分维持平衡 当血浆 渗透压降低时 过量水分进入细胞 细胞膨胀成球形 甚至破裂 血 红蛋白逸出 称为溶血 hemolysis 2 白细胞 白细胞 leukocyte white blood cell 为无色 有核的球形细胞 体积比红细胞大 能作 变形运动 具有防御和免疫功能 白细胞分类 光镜下 根据白细胞胞质有无特殊颗粒 可将其分为 有粒白细胞和无粒白细胞两类 有粒白细胞又根据颗粒 的嗜色性 分为中性粒细胞 嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒 细胞 无粒白细胞有单核细胞和淋巴细胞两

3、种 2 1 中性粒细胞 中性粒细胞 neutrophilic granulocyte neutrophil 占白细胞总 数的50 70 是白细胞中数量最多的一种 具有活跃的变形 运动和吞噬功能 细胞呈球形 直径10 12 m 核染色质呈团块状 核的形态多 样 有的呈腊肠状 称杆状核 有的呈分叶状 叶间有细丝相 连 称分叶核 中性粒细胞异常 中性粒细胞增高见于 a 急性感染和化脓性感染 肺炎 败血症 脓肿等 b 组织损伤 大手术后 心肌梗塞 肺梗塞等 c 恶性肿瘤 急 慢性白血病 淋巴瘤等 d 各种中毒 尿毒症 糖尿病酸中毒等 中性粒细胞减少见于 a 某些传染病 流感 伤寒 付伤寒 麻疹 b 某

4、些血液病 再障 粒细胞缺乏症 白细胞减少症 c 化疗或放疗后 抗癌药物 X线及镭照射 d 其它 脾功能亢进 自身免疫性疾病 高度恶病质 2 2 嗜酸性粒细胞 嗜酸性粒细胞 eosinophilic granulocyte eosinophil 占白细胞总 数的0 5 3 与变态反应有关 并有吞噬抗原抗体复合物的 作用 细胞呈球形 直径10 15 m 核常为2叶 胞质内充满粗大 直径0 5 1 0 m 均匀 略带折光性的嗜酸性颗粒 染成桔 红色 嗜酸性粒细胞异常 嗜酸性粒细胞增多见于 a 变态反应性疾病 支气管哮喘 药物过敏 荨麻疹等 b 寄生虫病 蛔虫病 钩虫病 血吸虫病 c 某些皮肤病 湿疹

5、 牛皮癣 剥脱性皮炎等 d 某些血液病 慢粒 恶性淋巴瘤 嗜酸性粒细胞性白血症等 嗜酸性粒细胞减少见于 a 应用糖皮质激素 促肾上腺皮质激素 b 伤寒 副伤寒等病患者 2 3 嗜碱性粒细胞 嗜碱性粒细胞 basoophilic granulocyte basophil 数量 最少 占白细胞总数的0 0 15 细胞呈球形 直径10 12 m 胞核分叶或呈S形或不规 则形 着色较浅 胞质内含有嗜碱性颗粒 嗜碱性粒细胞主要参与特殊的免疫反应 嗜碱性粒细胞异常 增多见于 a 慢性粒细胞白血病 嗜碱性粒细胞白血病 b 某些转移癌及骨髓纤维化 减少一般无临床意义 2 4 淋巴细胞 淋巴细胞 lymphoc

6、yte 占白细胞总数的20 30 圆 形或椭圆形 大小不等 T细胞约占淋巴细胞总数的75 参与细胞免疫 如排斥 异移体移植物 抗肿瘤等 并具有免疫调节功能 B细胞约占血中淋巴细胞总数的10 15 B细胞受抗 原刺激后增殖分化为浆细胞 产生抗体 参与体液免 疫 淋巴细胞异常 增多见于 a 某些病毒或细胞所致的传染病 传染性淋巴细胞增多症 传染性单核 细胞增多症 传染病恢复期 结核病 百日咳 b 淋巴细胞性白血病 白血性淋巴肉瘤 减少见于 a 应用肾上腺皮质激素 接触放射线 b 细胞免疫缺陷病 某些传染病的急性期 2 5 单核细胞 单核细胞 monocyte 占白细胞总数的3 8 具有游走性和 吞

7、噬作用 单核细胞为白细胞中体积最大的细胞 直径14 20 m 呈圆形 或椭圆形 胞核形态多样 呈卵圆形 肾形 马蹄形或不规则 形等 胞质较多 呈弱嗜碱性 含有许多细小的嗜天青颗粒 单核细胞异常 增多见于 a 某些感染 伤寒 结核 疟疾 黑热病 亚急性细菌性心内膜炎 b 某些血液病 单核细胞性白血病 淋巴瘤 骨髓异常增殖综合症 恶 性组织细胞病 减少一般无临床意义 二 血液物理特性 血液密度为 1 050 1 060 10 3kg m 3 红细胞的密度为 1 090 10 3kg m 3 血浆的密度为 1 025 1 030 10 3kg m 3 血液的颜色 通常抽的是静脉血 所以外观看上去呈暗

8、红色 若血含较多的是高铁血红蛋白或其他血红蛋白衍生 物 则呈紫黑色 血浆 或血清 因含少量胆红素 看上去呈透明淡 黄色 若含乳糜微粒 则呈乳白浑浊 若发生溶血 则呈红色血浆 三 血液采集常用方法 红色试管帽采血管 采血管中不含任何添加剂 适用于常规生化血清检验 对 检验结果无影响 缺点 离心 不到位或者温育时间不够 容 易形成纤维蛋白 容易堵塞设 备针孔 三 血液采集常用方法 紫色试管帽采血管 采血管中含EDTA K2抗凝剂 一 般采取喷雾制作 使得抗凝剂 均匀分布管壁 制备标本为全 血 一般适用于常规的血液学 检测 常用抗凝剂 1 乙二胺四乙酸二钠 简称EDTANa2 抗凝原理 可螯合血液中

9、的钙离子而阻止血液凝固 优点 抗凝作用强 且不改变血细胞的形态和体积 可防止血小 板聚集 应用 适于血液学检验 但输血不能用 草酸盐合剂 草酸钾及草酸铵合剂 抗凝原理 夺取血中的游离钙而形成不溶解的草酸钙 而达到抗 凝 优点 溶解度大 抗凝作用强 缺点 草酸钾使红细胞缩小约6 而草酸铵可使红细胞膨胀 应用 适于除红细胞压积容量测定的血液检验 常用抗凝剂 2 枸橼酸钠 柠檬酸钠 抗凝原理 与血中游离钙离子形成非离子化的可溶性的枸橼酸钙复合物 从而阻止血液凝固 优点 与血中游离钙离子结合松散 缺点 引起水及无机盐在血细胞及血浆之间分布的改变 应用 常用于血沉淀及输血时的抗凝 不适用于血液化学检验

10、肝素 抗凝原理 阻止血中的凝血酶原转变为凝血酶 防止血凝 优点 抗凝作用强 不影响红细胞的大小 对血液化学分析干扰少 缺点 价格贵 抗凝时间短 其抗凝血做白细胞分数计数时 白细胞着 色不佳 应用 血液有机成分 无机成分的分析 四 血液成分分离 1 血清血浆分离 2 白细胞分离 2 1 裂解红细胞法 2 2 Ficoll分离法 1 血清血浆的分离 血清和血浆的最大区别就是血清中不含纤维蛋白 原 紫色采血管颠倒混匀后 1200g 离心10min 4度 取上清 红色采血管需用枪头搅匀后 1200g 离心10min 4度 取上清 2 1 白细胞分离 裂解红细胞法 红细胞裂解液主要成分 NH4Cl KH

11、CO3 Na2EDTA 红细胞裂解液裂解原理 氯化铵通过在其细胞膜 进行氢氧根 碳酸氢根和氯离子的交换 改变其 渗透压 造成红细胞胀大破裂 外周血淋巴细胞 受影响较少因其细胞膜的离子转运通道不同 2 1 白细胞分离 裂解红细胞法 主要实验流程 将10X储存液稀释到1X工作浓度 加入血沉棕黄层的6 10倍体积的1X红细胞裂解液 吹打均 匀 冰上裂解10分钟 裂解完毕后 50ml离心管中液体应呈透 明红色 且下方无红色沉淀 1500g 10min 4度离心 弃去上层液体 仅保留下层白 色沉淀 2 2 白细胞分离 Ficoll分离法 原理 常用来分离人外周血单个核细胞 PBMC 的分层液比重是 1

12、077 0 001 的聚蔗糖 Ficoll 泛影葡胺 Urografin F H 分层 液 Ficoll是蔗糖的多聚体 中性 平均分子量为400 000 不穿 过生物膜 红细胞 粒细胞比重大 离心后沉于管底 淋巴细 胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重 离心后漂浮于分 层液的液面上 也可有少部分细胞悬浮在分层液中 吸取分层 液液面的细胞 就可从外周血中分离到单个核细胞 2 2 白细胞分离 Ficoll分离法 Part 2 离心机简介及使用 1 离心机简介 离心机 借助转轴高速旋转产生离心力 使不同密度 不同大小 的物质分开 能达到初步分离纯化的目的 是实验室必不可少 的仪器 按照转速可以分为

13、低速 50000 三种类型 根据体积大小和摆放位置又可分为台式离 心机 和落地式离心机 台式离心机体积比较小 常是中低速离 心机 落地式离心机体积较大 常带有降控温装置 大多是高 速离心机 2 离心机的摆放 离心机一般放在干燥 避免阳光直射的地方 离心机散热量比较大 周围不要堆放杂物 四周 离墙壁 挡板等不透气 散热性差的物品至少 10cm以上 离心机尽量单独放在一个房间 周围绝对不要放 有机试剂 易燃品 3 离心机使用注意事项 根据实验所需和使用的离心管 含有有机试剂的 液体要用特殊的离心管 选择合适的转头 转速绝对禁止超过转头标明的 最高转速 离心管的对称放置和重量配平 同时应该注意离 心

14、管和转头可以承受的最大重量的溶液 液体最 多装离心管全体积的3 4 4 离心机保养 每次使用完毕 都要将离心机盖儿打开 使得热量或者 水气自然蒸发 如之前使用了低温离心 可能有结冰 则要等冰融化 及时用干燥棉纱布擦洗干净 等无明显 水汽时再盖上盖子 如果离心机转头可以替换 则每个转头使用完毕后都要 及时取出 用干净的 干燥的医用纱布擦洗干净 倒扣 放置 切勿使用锐器刮擦 操作人员离开时候要切断电源 5 具体操作流程 1 1 设定使用温度 通常为4 后 先把离心陀放入离心舱中 注意离心陀要卡好轴心 关上舱门 离心 舱的温度开始下降 预冷时间要充足 2 把样本装入适当的离心管 双双用天平平衡重量

15、盖上离心管盖子并旋紧 1 注意离心管只装七成满 虽然加有盖子 但也可能因离心力太强而外泄 2 离心管通常都会放在碎冰上 注意取出平衡时 要把碎冰的液体擦拭干净 3 落单的离心管要用另一只装有清水的离心管平衡 3 把平衡好的离心管对称地放入离心陀中 盖上离心陀的盖子 注意有无旋紧 4 关上离心机舱门 在仪表板上调好所要的转速与时间 5 确定所有步骤无误后 按Start 钮开动 离心机渐渐加速 此时要密切监控 1 如在运行中听到不正常声音或者闻到什么异味 应立即采取刹车 按 停止 键 必要时还要 切断电源 2 仪器运行期间 绝对禁止打开离心机盖 3 等到离心达到所要的转速后 确定一切正常才可离去

16、5 具体操作流程 2 6 完成离心时 要等离心陀完全静止后 才能打开舱门 请尽快取出离心管 先观察离心管 是否完全 以及沉淀的位置 1 若不慎将上清和沉淀混在一起 就要重来一次 2 若离心管有漏 要找出原因 并且立刻清理离心陀或离心舱 7 在两次离心之间的空档 不需取出离心陀 但盖上舱门 勿让热空气流入离心舱 8 全部使用完毕后 取出离心陀清理 离心舱门要打开 等结冰融化后 再稍加擦拭及清理 若有液体漏出 要用清水洗之 也要回头检查平衡离心管的天平以及桌面 9 实验室人员养成良好的登记习惯 第一可以知道之前谁用过 之前用时仪器状况 第二可 以知道离心机使用的次数 从而得知是否需要检修或者更换