《水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定 分光光度法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定 分光光度法（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、ICS07.080G60中华人民共和国国家标准GB/T XXXXXXXXX水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定方法 分光光度法Determination of reducing-end sugar in chitosan Spectrophotometry（本稿完成日期：XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施GB/T XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T 1.1-2009 标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由全国生化检测标准化技术委员会提出并归口。本标准由 负责起草。本标准主要起草人： 水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定方法 分光光度法1 范
2、围本标准规定了用分光光度法测定水溶性壳聚糖中的还原性端基糖。本标准适用于生化试剂水溶性壳聚糖产品的生产、监督和检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB-T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 壳聚糖 chitosan壳聚糖是由氨基葡萄糖以糖苷键（氨基葡萄糖分子上的半缩醛与另一氨基葡萄糖分子不同位置上的羟基形成的-糖苷键和/或-糖苷键）聚合（聚合度至少超过10以上的）而成的高分子碳水化合物。3.2 水
3、溶性壳聚糖 water-soluble chitosan是指不仅溶于酸性溶液，还可溶于中性溶液和碱性溶液的低聚合度壳聚糖,其脱乙酰度95%。 3.3 壳聚糖中的还原性端基糖 reducing-end sugar in chitosan 壳聚糖分子中的还原端基糖是指壳聚糖分子链的末端具有游离半缩醛基，即具有还原性端基的氨基葡萄糖单元，以相当于此氨基葡萄糖单元的氨基葡萄糖表示，其含量以每克水溶性壳聚糖所含有的还原性端基糖的摩尔量表示。4 原理壳聚糖的还原性端基糖首先在碱性条件下与MBTH（3-甲基-2-苯并噻唑酮腙）反应生成吖嗪，在酸性条件下，过量的MBTH被Fe3+氧化成阳离子，再与吖嗪反应生成
4、青蓝色化合物，还原端基糖的浓度在一定范围内与其颜色强度呈正比例线性关系。因此，通过分光光度法测定反应液颜色的强度，即可计算壳聚糖中还原性端基的含量。5 主要试剂与溶液除非另有说明，本标准仅使用确认为分析纯的试剂。5.1 水：符合GB/T 6682中三级水的要求5.2 120 g/mL 盐酸氨基葡萄糖标准溶液称取盐酸氨基葡萄糖 0.1000 g ，用水溶解并定容至100 mL。充分混匀后，从中取12 mL，用水稀释并定容至100 mL。5.3 NaOH溶液，0.5 mol/L称取NaOH 2.00g。加水溶解，定容至100 mL。5.4 MBTH试剂3 mg/mL MBTH（3-甲基-2-苯并噻
5、唑酮腙）溶液：称取MBTH 0.300 g，加水搅拌溶解并稀释定容至100 mL。于4冰箱避光贮存，有效期为10d。0.8 mg/mL DTT （二硫苏糖醇）溶液：称取0.080 g，加水搅拌溶解并稀释定容至100 mL。于4冰箱避光贮存，有效期为10d。将上述MBTH溶液和DTT溶液等体积混合，即得MBTH试剂。现用现配。5.5 硫酸铁铵试剂称取5.00 g 硫酸铁铵（NH4Fe (SO4)212H2O）、5.00 g 氨基磺酸，加水溶解，然后移入41.8 mL浓盐酸，待充分溶解后，加水搅拌溶解并稀释定容至1 000 mL。于4避光保存，有效期为30天。6 仪器与设备及器具除实验室常用仪器设
6、备外，应有下述仪器设备：6.1 分析天平：精度为0.0001 g和0.01 g。6.2 恒温震荡水浴锅（或带磁力搅拌的普通水浴锅）：精度为0.2。6.3 分光光度计：波长范围380-780 nm 吸光度值精度为0.001。6.4 1cm石英比色皿。7 分析步骤7.1 标准曲线绘制分别移取120 g/mL 盐酸氨基葡萄糖标准溶液（5.1）0 L、250L、500 L、750 L、1000 L、1250 L、1500 L、1750 L、2000 L与分别2 000 L、1750 L、1500 L、1250 L、1000 L、750 L、500 L、250 L、 0 L 水混合，配成盐酸氨基葡萄糖质
7、量浓度分别为0 g/mL、15 g/mL、30g/mL、45 g/mL、60 g/mL、75 g/mL、90 g/mL、105 g/mL、120 g/mL的氨基葡萄糖标准工作溶液。分别移取氨基葡萄糖标准工作溶液400 L，加400 L 0.5 mol/L氢氧化钠溶液（5.2）和400 L MBTH试剂（5.3）于试管中（每个浓度做三个平行），混匀，于80 C水浴13 min，趁热迅速加入800 L硫酸铁铵试剂（5.4），混匀显色1 hr，用1 cm比色皿于590 nm下测定，即得单糖浓度为零的空白管和单糖标准工作液的标准管的吸光度值。每个浓度做三个平行。以单糖的质量浓度为横坐标，以标准管的平均
8、吸光度值与单糖质量浓度为零的空白管的平均吸光度值的差值为纵坐标绘制标准曲线，获得线性回归方程，回归系数（r2）在0.999以上时方可使用。8 试样的制备8.1 固体样品的制备称取水溶性壳聚糖0.1000 g，加入水使其溶解，定容至100 mL，得到1 mg/mL壳聚糖溶液。8.2 液体样品的制备将1 mg/mL 水溶性壳聚糖溶液（8.1）0 L、400L、800 L、1200 L、1600 L、2000 L分别与2 000 L、1600 L、1200 L、800 L、400 L、 0 L 水混合，配成质量浓度分别为0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.
9、8 mg/mL、1 mg/mL的水溶性壳聚糖溶液，其稀释倍数分别为5、2.5、1.67、1.25和1。9 测定步骤分别移取壳聚糖工作溶液400 L，加400 L 0.5 mol/L氢氧化钠溶液（5.2）和400 L MBTH试剂（5.3）于试管中（每个浓度做三个平行），混匀，于80 C水浴13 min，趁热迅速加入800 L硫酸铁铵试剂（5.4），混匀显色1 hr，用1 cm比色皿于590 nm下测定，即得壳聚糖浓度为零的空白管和壳聚糖工作溶液的样品管的吸光度值。每个浓度做三个平行。得到样品空白管和样品管的吸光度值。取样品管的平均值与样品空白管的平均值之差，通过线性回归方程求出生成的还原糖的量
10、。10 样品多糖中还原端基糖的计算与表示10.1 样品多糖中还原端基糖的计算样品中还原端基糖含量按式计算，计算值保留三位有效数字。 X - 试样中还原端基糖的浓度，mol/g；AE - 样品管的平均吸光度值；AB - 样品空白管的平均吸光度值；k - 标准曲线（6.4）的斜率，g/mL；C0 - 标准曲线（6.4）的截距，g/mL；m - 样品的质量或体积，g或mL；t - 酶解反应时间，min；M - 盐酸氨基葡萄糖的分子量N - 稀释倍数m - 水溶性壳聚糖的质量浓度（mg/mL）10.2 样品多糖的计算结果表示 以平行样的平均值为最终的样品多糖还原端基糖的测定值，以mol/g表示，计算结果保留小数点后三位。 11 重复性每个试样应取至少三份平行样进行分析测定，相对误差不超过5.0%，三者的平均值为最终的还原性端基糖的测定值。5
