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1、植物源农药的提取分离和结构鉴定基础 一 基本概念 1 提取 利用适当的溶剂或方法 将所 要成分尽可能从原料中完全提出的过程 2 分离 将提取物中所含的各种成分一 一分开 并将得到的单体加以精制的过 程 第一节 植物源农药的提取 水 亲水性有机溶剂 亲脂性有机溶剂 二 提取方法 l超临界流体萃取法 SFE l水蒸气蒸馏法 l溶剂提取法 l升华法 l压榨法 溶剂 一 溶剂提取法 根据天然成分的溶解性不同 选用对 所需成分溶解度大而对其他成分溶解度小 的溶剂 将所需成分从生物材料中溶解出 来的一种提取方法 溶剂提取是指溶剂进入生物体细胞 溶解或分散其有用物质而变成浸出物的全 过程 包括浸润 解吸和扩
2、散三个阶段 1 溶剂提取法的原理 选择溶剂依据相似相溶原理 浸润 渗透阶段 溶剂通过细胞壁渗透到细胞中 解吸 溶解阶段 细胞内容物与细胞组织之间有亲和 力 溶剂破除这种亲和力 扩散 置换阶段 利用细胞内的渗透力产生的压差而抽 提出来 用溶剂占领内容物的位置而将内 容物置换出来 扩散过程表达式 dt 扩散时间 F 扩散面积 以粉碎度表示 浓度差 D 扩散系数 ds 在dt时间内的扩散量 2 选择溶剂的要点 对所要成分溶解度大 沸点适中容易回收 低毒安全 廉价 天然产物成分中 萜 甾等大环 稠环化 合物极性小 易溶于氯仿 乙醚等 糖 苷等 易溶于水 乙醇等极性溶剂中 酸碱性成分因 存在状态不同溶解
3、性不同 最常用的溶剂为乙醇 3 溶剂的分类 强极性溶剂 水 亲水性有机溶剂 能与水任意混溶 甲醇 乙醇 丙酮 亲脂性有机溶剂 不与水任意混溶 可分层 正丁醇 乙醚 乙酸乙酯 氯仿 二氯甲烷 环己烷 石油 醚 常用溶剂的极性大小顺序 石油醚 四氯化碳 苯 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 正丁醇 丙酮 乙醇 甲醇 Kb K CU CL CU CL为被分离物质在上相和下相中浓度 1 萃取法 利用混和物中各成分在两种互不相溶的溶剂 中分配系数不同而达到分离的方法 根据 值的大小可决定分离采用的方法 100 简单的一次萃取 可基本分离 10 数次乃至10余次萃取 CCD法 2 100次以上萃取 DCCC法 HSC
4、CC法 1 不能分离 可以根据PC法计算 值 选择理想的分离条件 2 沉淀分离法 根据溶解度的不同 控制溶液条件使溶液中的化 合物或离子分离的方法统称为沉淀分离法 方法 的主要依据是溶度积原理 根据沉淀剂的不同 沉淀分离也可以分成用无机 沉淀剂的分离法 用有机沉淀剂的分离法和共沉 淀分离富集法 沉淀分离法和共沉淀分离法的区 别主要是 沉淀分离法主要使用于常量组分的分 离 毫克 量级以上 而共沉淀分离法主要使用 于痕量组分的分离 小于1mg mL 常用的沉淀分离方法及试剂 1 无机沉淀剂 氢氧化物 硫化物 其它沉淀剂 2 有机沉淀剂 草酸 铜试剂 铜铁试 3 结晶和重结晶 在化学里面 热的饱和溶
5、液冷却后 溶质以晶体 的形式析出 这一过程叫结晶 重结晶是将晶体溶于溶剂或熔融以后 又重新从 溶液或熔体中结晶的过程 重结晶可以使不纯净 的物质获得纯化 或使混合在一起的盐类彼此分 离 重结晶提纯法的一般过程 1 溶剂选择 2 固体物质的溶解 3 杂质的除去 4 晶体的析出 5 晶体的收集和洗涤 6 晶体的干燥 4 膜分离 利用膜的选择性分离实现料液的不同组分的分 离 纯化 浓缩的过程称作膜分离 液膜分离过程分为乳 化液膜和固定液膜的分 离过程 合成膜的分离过程包 括微过滤 超过滤 反 渗透 气体渗透分离 渗透蒸发 渗析及电渗 析等过程 二 柱色谱 1 吸附柱色谱 吸附分类 物理吸附 无选择性
6、吸附 吸附 解吸附发生迅速 吸附 剂如硅胶 氧化铝 活性炭等 化学吸附 不可逆吸附 如碱性氧化铝对酚酸性成分的 吸附 酸性硅胶对生物碱的吸附等 半化学吸附 聚酰胺对酚酸类 醌类的氢键吸附 吸附原理 相似相吸 影响吸附过程的三要素 吸附剂 固定相 溶质 被分离物质 溶剂 洗脱剂 展开剂 流动相 2 硅胶 氧化铝 极性吸附剂 载样量大 吸附力强 硅胶 有中性 酸性之分 适用于各类成分分离 氧化铝 有中性 酸性 碱性之分 不适合于分离 酸性成分 多用于分离生物碱 被分离物质吸附力与结构的关系 被分离物质极性大 吸附力强 难洗脱 Rf 值小 官能团极性大小排列顺序 COOH Ar OH R OH R
7、NH2 RNHR RNR R RCONRR RCHO RCOR RCOOR ROR RH 溶剂 洗脱剂 的极性与洗脱力的关系 洗脱剂极性越大 洗脱力越强 大黄酸大黄素大黄酚 酸性最强酸性其次酸性最弱 溶于NaHCO3溶于Na2CO3溶于NaOH 例 从黄花夹竹桃果仁中分离到七种强心苷成分 根据极性大小推测从硅胶柱上的洗脱顺序 名称RR 黄夹夹苷ACHO D glc 2 黄夹夹苷BCH3 D glc 2 黄夹夹次苷ACHOH 黄夹夹次苷BCH3H 黄夹夹次苷CCH2OHH 黄夹夹次苷DCOOHH 单单乙酰酰黄夹夹次苷 B CH3H 单乙酰黄夹次苷B R COCH3 其它R H 3 活性炭 非极性
8、吸附剂 吸附力与结构的关系 分子量大者 分子量小者 芳香族 脂肪族 活性炭和芳香族均有平面型 分子的缘故 含OH COOH NH2多者 少者 3 活性炭 非极性吸附剂 溶剂的洗脱力 吡啶 15 酚 醇 7 酚 H2O 醇 含水醇 H2O 黄酮 生物碱的富集 糖的分离 脱色等 应用 4 聚酰胺 Polyamide 由己酰胺聚合成的一类高分子化合物 分离原理 主要 通过酰胺与酚 酸 醌等化合物 形成氢键 吸附 能力取决于氢键 的强弱 2 分配柱色谱 液 液柱色谱法 其固定相和流动相均为液 体 液态固定相又称固定液 被涂渍在惰 性材料载体上构成固定相 分配柱色谱法 的优点是 稳定性高 重现性好 适用
9、样 品的类型广等 固定相极性小于流动相 如HPLC反相色谱柱 反相薄层 色谱板 固定相 硅胶的硅醇基与烷基结合 如RP 2 RP 8 RP 18 亲脂性 RP 18 RP 8 RP 2 流动相 洗脱剂 MeOH H2O CH3CN H2O 洗脱顺序 分离极性大的成分 极性大者先被洗脱出来 固定相的表面修饰 3 离子交换色谱 离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团 这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的 离子结合 如果流动相中存在其他带相反电荷的 离子 按照质量作用定律 这些离子将与结合在 固定相上的反离子进行交换 固定相基团带正电 荷的时候 其可交换离子为阴离子 这种离子交 换剂为阴离子
10、交换剂 固定相的带电基团带负电 荷 可用来与流动相交换的离子就是阳离子 这 种离子交换剂叫做阳离子交换剂 阴离子交换柱的功能团主要是 NH2 及 NH3 阳离子交换剂的功能团主要是 SO3H及 COOH 其中 NH3 离子交换柱及 SO3H离子交换剂 属于强离子交换剂 它们在很广泛的pH范围内都 有离子交换能力 NH2及 COOH 离子交换柱属于 弱离子交换剂 只有在一定的pH值范围内 才能 有离子交换能力 离子交换色谱主要用于可电离 化合物的分离 例如 氨基酸自动分析仪中的色 谱柱 多肽的分离 蛋白质的分离 核苷酸 核 苷和各种碱基的分离等 4 凝胶层析 Gel Penetration Ch
11、romatography GPC 葡聚糖凝胶 交联葡聚糖是由一定平均分子量的葡聚糖和 交联剂 一般为环氧氯丙烷 以醚桥的形式互相 交联形成的三维空间网状结构高分子材料 是水 不溶性的白色球状颗粒 酸性环境能水解 碱中 稳定 在样品通过一定孔径的凝胶固定相时 由于 流经路径的不同 使不同相对分子量的组分得以 分离的方法 表面有孔隙 其大小决定于聚糖与交联剂 的配比及反应条件 商品型号即按凝胶的交联度大小分类 并 以吸水量来表示 英文字母G代表葡聚糖凝胶 后面的数字表示每克凝胶吸水量 再乘以10 的值 G 25的吸水量为每克2 5ml 交联度大 网状结构越紧密 孔隙越小 吸 水膨胀越少 型号吸水量
12、 ml g 床体积积 ml g 分离范围围最小溶胀时间胀时间 肽肽与蛋白质质多糖室温沸水 G 101 02 3小于700小于70031 G 151 52 5 3 5小于1500小于150031 G 252 54 61000 5000100 500062 G 505 09 111500 3万500 1万62 G 757 512 153000 7万1000 5万243 G 1001015 20400015万1000 10万485 G 1501520 305000 40万1000 15万725 G 2002030 405000 80万1000 20万725 凝胶的型号与使用范围 层析原理 绝大部分在
13、水溶液中进行 凝胶颗粒在适当 溶剂中浸泡 待充分膨胀后装入层析柱 加样后 用同一溶液洗脱 在洗脱过程中 较小的分子渗 入凝胶 较大的分子随溶液流动 分子量小的物 质 阻滞作用大 可通过凝胶网孔进入粒子内部 然后扩散出来 故流程长 移动速度慢 后流 出色谱柱 分子量大的物质沉凝胶粒子间孔隙 随洗脱液移动 流程短 移动速度快 先流出色 谱柱 不同的化合物由于其大小差异 在流经GPC柱时 不同 分子量的化合物流经体积不同 大分子不能或难以进入凝胶 网格结构的内部 直接从凝胶颗粒之间穿过 保留时间短 而小分子恰恰相反 保留时间较长 而得以分离 常用术语 Vt 床体积 凝胶装柱以后 柱床所占的体积 Vo
14、 外水体积 柱床内存在于凝胶外面的水相 体积 Vi 内水体积 凝胶颗粒内部所含的水相体积 Vg 凝胶本身体积 相互关系 Vt Vo Vi Vg Ve 洗脱体积 自样品加入时算起 至流出组 分最大浓度出现时 所流出的体积 同一类型化合物 洗脱特征与组分分子量有 关 Ve K1 K2logM 说明不同组分流经凝胶柱时 按分子量大小 顺序流出 分子量大的 洗脱体积小 最先流出 当条件固定时 Ve重现性很好 按此特性可测大分子物质的分子量 用已知分子量的物 质分别相继上柱 5mg 流出液按每管2 4ml收 集 通过硫酸蒽酮显色 再经紫外检测 分别求得 洗脱体积Ve 再用蓝色葡 聚糖测出柱床的外水体积
15、Vo 按Ve Vo与分子量对 数关系作图 得标准曲线 最后将待测物质分子量 用少水溶解上柱 在同样 条件下测定Ve 根据 Ve Vo 查标准曲线 测 得物质分子量 局限性 1 要有标准样 2 不同的待测物质 要有不同的标准样 操作技术 溶胀 不同凝胶溶胀时间不一样 G 100室温下最 小水化时间72h 除微颗粒 目的 充分吸水 各 孔隙舒张 以利于物质分子通过 装柱 柱内加少量洗脱液 排除底部气泡 然后将 凝胶浆倒入 让其自然沉降 打开出口 柱床表面 不再下沉即紧密 装好的柱应不含气泡 柱床表面 平坦 平衡 用3倍床体积洗脱液让柱平衡流动2 3天 至流速恒定 加样 平衡后 床表面应有1 2cm
16、的洗脱液 用吸管沿柱壁加入 打开出口 当上面液体刚 好全部渗入柱内时 滴加洗脱液 注意不能振 动床表面 上样品要体积小 浓度大 这样峰形好 洗脱 一般用水和电解质溶液 如酸 碱 盐的 溶液及缓冲溶液 加入5cm以上洗脱液时 可接高 位瓶中的洗脱液 洗脱分阶段洗脱和梯度洗脱 收集 分部收集器收集 检出 蛋白质 核苷酸 多肽用紫外光谱仪在 280nm 260nm 230nm测吸光度值 以样品体积 或管数 为横座标 吸光度为纵座标 画出洗脱 曲线 5 大孔树脂柱色谱 大孔吸附树脂的吸附实质为一种物体高度分散或 表面分子受作用力不均等而产生的表面吸附现象 这种吸附性能是由于范德华引力或生成氢键的 结果 同时由于大孔吸附树脂的多孔结构使其对 分子大小不同的物质具有筛选作用 通过上述这 种吸附和筛选原理 有机化合物根据吸附力的不 同及分子量的大小 在大孔吸附树脂上经一定溶 剂洗脱而达到分离 纯化 除杂 浓缩等不同目 的 吸附树脂的表面发生吸附作用后 会使树脂 表面上溶质的浓度高于溶剂内溶质的浓度 其结 果引起体系内放热和自由能的下降 大孔吸附树脂按其极性大小和所选用的单体分子 结构不同 可分为非极
