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1、生物专题细胞生物学研究方法 显微镜 细胞学说电子显微镜与分子生物学结合 细胞生物学才能有今天的发展 结构与功能 动态特征 细胞的生命活动 实验科学与实验技术 细胞真知源于实验室 第一节细胞形态结构的观察方法 光学显微镜技术 lightmicroscopy 电子显微镜技术 Electromicroscopy 扫描探针显微镜 ScanningProbeMicroscope 扫描遂道显微镜 scanningtunnelingmicroscope 一 光学显微镜技术 lightmicroscopy 最早的光学显微镜是1590年Janssen和他的侄子共同研制的 其后 RobertHooke和Leeuw
2、enhoek对光学显微镜的分辨本领进行了极大的改进 由此发现了细胞 20世纪30年代发展起来的电子显微镜导致细胞结构和功能研究发生了一次革命 使生物学家得以从亚显微水平上重新认识细胞 光学和电子显微镜成像原理不管是何种显微镜 镜像的形成都需要三个基本要素 照明系统 被观察的样品 聚焦和成像的透镜系统 透射 焦距与角孔径焦距 focallength 是透镜的中心平面到焦点的距离 而角孔径 angularaperture 是光从样品进入显微镜的物镜半角 因此角孔径实际表示有多少光离开样品通过透镜 角孔径越大 透过透镜的信息越多 分辨率 透镜最重要的性质就是它的分辨率 分辨率 R 可用以下公式计算
3、R 0 61 nSin 其中 n 聚光镜和物镜之间介质的折射率 空气为1 油为1 5 样品对物镜角孔径的半角 sin 的最大值为1 照明光源的波长 0 61是一个恒定的参数 表示成像的点虽被重叠但仍能被区别的程度 从上式可知 角孔径越大 进入物镜的光越多 介质的折射率越大 则数值孔径越大 这些都可以使分辨率提高 由于分辨率表示的是能够区别两个点间最近距离的能力 所以R值越小 分辨率越高 从分辨率的表达式来看 或者波长越短 分辨率越高 分辨极限 limitresolution 与放大率 magnification 对可见光来说 能清楚地分辨出相邻两点之间的最小间隔是0 2 m 称之为分辨极限 最
4、终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率 总放大率 物镜放大率 目镜放大率 放大率同样受分辨极限的限制 一般来说 光学显微镜的最大放大率只能是透镜的数值孔径的1000倍 由于透镜的数值孔径的范围是1 0 1 4 所以光学显微镜在用空气作介质时最大放大倍数为1000倍 用油镜则为1400倍 增大角孔径或缩短波长可提高光学显微镜的分辨率 如果用波长比普通波长短得多的电子波代替光波 分辨率可大大提高 电子显微镜就是在这种需求下被发明的 表电子显微镜与光学显微镜的基本区别 1 常用的光学显微镜 光学显微镜 lightmicroscope 是光学显微技术的主要工具 自问世以来已有400多年历史 光学显微
5、镜是利用光线照明 使微小物体形成放大影像的仪器 现今使用的光学显微镜都是由几个透镜组合而成 所以又称为复合显微镜 普通双筒显微镜 比较高级的显微镜上都设有倾斜式的双目镜筒 在物镜转换器上方装有四个棱镜 使经过物镜的光线平分为两路到达目镜 故双筒显微镜的亮度要比单筒者为暗 双筒显微镜的优点为同时用两眼观察 有较强的立体感 基本构造 光学放大系统 照明系统 机械和支架系统 石蜡切片技术 荧光显微镜技术 FluorescenceMicroscopy 荧光显微镜的工作原理是利用紫外线发生装置 如弧光灯 水银灯等 发出强烈的紫外线光源 通过照明设备把显微固定的切片或活染的细胞透视出来 荧光显微镜原理 相
6、差显微镜 phasecontrastmicroscope 相差显微镜在结构上进行了特别设计 尤其是光学系统有很大的不同 可用于观察未染色的活细胞 相差显微镜是能将物体本身的相位差转换为振幅差的显微镜 在普通光镜下观察标本时 是靠颜色 波长 和亮度 振幅 的差别而看到被检物体的结构 而活细胞近于无色透明 光波通过不吸收光 振幅变化不大 故人眼感觉不到 为解决这一难题 30年代 1934 1935 荷兰物理学家Zernike设计制造出相差显微镜 并用此而获1953年诺贝尔奖 相差显微镜的光学部件及光线通路 相差显微镜观察的活细胞 暗视野显微镜 darkfieldmicroscope 暗视野显微镜是
7、利用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大 在黑暗的背景下呈现明亮的像 这种特殊的照明方式 使反差增大 分辨率提高 用以观察未经染色的活体或胶体粒子 暗视野显微镜主要观察的是物体的轮廓 分辨不清内部的微细构造 适合于观察活细胞内的细胞核 线粒体 液体介质中的细菌和霉菌等 暗视野显微镜的光学 倒置显微镜 倒置显微镜的结构组成与普通显微镜一样 所不同的只是它的物镜与照明系统的位置颠倒过来 前者置于载物台之下 而后者在载物台的上方 集光器与载物台之间的工作距离提高 可以放置培养皿 培养瓶等容器 直接对培养的细胞进行照明和观察 光学显微镜的样品制备与观察 由于大多数细胞的成分不影响光线的穿透 无法形
8、成反差 所以在一般光学显微镜下 几乎看不清未经处理的细胞 为了看清细胞内含物 就必须对细胞样品进行一些特殊的处理 为此建立和发展了样品的各种制备技术 样品的固定 fixation 目的 生物组织在染色前先进行固定的目的是杀死细胞 稳定细胞的化学成份 并且使样品硬化以便在进一步的处理和切片时不会受到破坏 做法 样品固定的最简单做法是将样品直接浸泡在固定液中 固定使得大分子交联而保持在一定的位置上 不致于在以后的染色等处理过程中移位或丢失而产生人工假象 一般用具有缓冲作用的醛类固定液 用甲醛或戊二醛作固定剂 能够与蛋白质的游离氨基形成共价键 从而将邻近的蛋白质分子牢固地交联在一起 包埋和切片样品制
9、备的第二步是将固定的组织制备成切片 样品首先要被包埋在介质中 通常用液态的石蜡或树脂做包埋剂 使之渗入整块组织 然后将之硬化成固体的包埋块 用专门的切片机切割包埋块 制备成薄切片 适用于光学显微镜观察的切片厚度为l 10 m 染色 staining 大多数细胞总重量的70 是水 对可见光几乎是透明的 只有很少的内含物不透光 染色的目的就是给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征 19世纪初 发现某些有机染料可染生物组织 并对细胞特殊部位的着色具有选择性 如苏木精对负电荷分子有亲和性 能显示出细胞内核酸的分布 酸性染料如伊红可使细胞质染色 苏丹染料在脂肪中的溶解度比在乙醇中大 所以苏丹染料的乙醇饱和
10、溶液能使脂肪着色 但对许多染料的特异性染色机理尚不清楚 激光共焦扫描显微镜技术 LaserScanningConfocalMicroscopy 原理 应用 排除焦平面以外光的干扰 增强图像反差和提高分辨率 1 4 1 7 可重构样品的三维结构 2 电子显微镜技术自从第一台电子显微镜在德国诞生以来 取得飞跃发展并在生物学领域中得到广泛的应用 利用电镜可以观察到各种病毒的形态结构以及细胞器的微细结构 还能观察到许多生物大分子 目前的电镜已由单纯的形态描述进入了成分分析 定性和定量分析 此外 将电镜与计算机连用 对图象进行信息处理也取得了很大进展 总之 电镜已成为研究生物学的有力工具 必将发挥越来越
11、大的作用 1932年德国学者MaxKnolls和ErnstRuska发明了第一台电子显微镜 开拓了超微世界 发现了许多光镜下看不到的结构 如细胞膜 线粒体 细胞核 高尔基体 中心粒等细胞器的细微结构 将在光学显微镜中观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构称为亚显微结构 submicroscopestructure 或超微结构 ultrastructure 在种类上 电镜可分为两大类 透射电子显微镜和扫描电子显微镜 电镜与光镜的比较 光镜与电镜的主要区别 1 光源不同 光镜为可见光或紫外线 电镜为电子束 2 透镜不同 光镜为玻璃 电镜为电磁透镜 3 真空 4 显示记录系统 透射电子显微镜 TEM
12、 透射电子显微镜主要是让电子束穿透样片而成像 电子显微镜基本结构由三大部分组成 电子光学系统 镜筒 真空系统 电子学系统 供电系统 电子光学系统由照明系统 样品室 成像系统 观察窗和记录用的照相机等组成 由于电子显微镜必需在高度真空条件下进行工作 阴极与阳极之间会放电 灯丝也会因受到氧化或被阳离子轰击而缩短寿命 所以设计了真空系统 电子学系统即供电系统 需要高压稳压 电镜 透射电镜 与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造 扫描式电子显微镜1940年 英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜 直到1965年 才有英国剑桥科学仪器有限公司生产出实用性强的商品扫描电镜 由于扫描电镜具有显著的优点 因此
13、 几十年来 已广泛应用于生物学 医学 古生物学 地质学 化学 物理学 电子学以及勘察 冶金 机械与轻工业等领域 成为十分有用的研究工具 电子 探针 扫描 激发样品表面放出二次电子 探测器收集二次电子成象 CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题 主要电镜制样技术 超薄切片 负染色技术 冰冻蚀刻技术 电镜三维重构技术 超薄切片技术 取材 前固定 4 戊二醛 PBS洗残余的戊二醛后固定 4 C 锇酸 脱水 乙醇或丙酮包埋 环氧树脂 修片切片 600埃 银色 染色 醋酸铀与铅盐 观察 负染色 negativestainning 一些生物大分子组成的结构 如病毒 线粒体基粒 核糖体和蛋白质组成
14、的纤维等可以通过负染色电镜技术观察其精细结构 还可以从不同角度观察三维结构 负染原理 又称阴性反差染色 借助染色剂的衬托 增加背景对电子的散射 使样品相对地透过较多的电子 最后在荧光屏上形成暗背景下的 亮像 冰冻断裂复型和冰冻蚀刻是专门观察样品外表面的投影复型术 一 显微镜的种类及原理 5 透射电子显微镜 6 扫描电子显微镜 能否用扫描电镜来观察样品的内部结构 而用透射电镜来观察样品的表面结构 冰冻蚀刻技术 电镜三维重构技术 3 扫描遂道显微镜 扫描隧道显微镜由IBM公司瑞士苏黎世研究所的两位学者BinningG 和RohrerH 等在1981年发明的具有原子显像力的显微镜 是根据量子力学中的
15、隧道效应原理而制成的 这种显微镜对生物 物理 化学等学科均有推动作用 可用于研究表面的原子结构和电子结构 故于1986年获得了诺贝尔物理学奖 特点 1 可对晶体或非晶体成像 无需复杂计算 且分辨本领高 侧分辨率为0 1 0 2nm 纵分辨率可达0 01nm 2 可实时得到样品表面三维图象 可测量厚度信息 3 可在真空 大气 液体等多种条件下工作 非破坏性测量 4 可连续成像 进行动态观察 用途 纳米生物学研究领域中的重要工具 在原子水平上揭示样本表面的结构 扫描隧道显微镜 DNA双螺旋结构的建立是根据X射线衍射结果推导出来的 至今还没有直接观察DNA结构的方法 所以对其中的微细结构还不够了解
16、用STM观察了DNA的双螺旋结构 见到DNA分子上的大沟和小沟 并且了解DNA的结构随染色体长度而异 第二节细胞组分的分析方法 离心分离技术细胞内核酸 蛋白质 酶 糖与脂类等的显示方法特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性放射自显影技术定量细胞化学分析技术核酸分子杂交技术 一 离心分离技术 离心分离细胞组分是最常用的分离方法 因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度 可在不同离心力的作用下沉降分离 用途 于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心 分离密度不同的细胞组分 密度梯度离心 精细组分或生物大分子的分离 差速离心 differentialcentrifugation 主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器 起始的离心速度较低 让较大的颗粒沉降到管底 小的颗粒仍然悬浮在上清液中 收集沉淀 改用较高的离心速度离心悬浮液 将较小的颗粒沉降 以此类推 达到分离不同大小颗粒的目的 差速离心 密度梯度离心 二 细胞内核酸 蛋白质 酶 糖与脂类等的显示方法 原理 利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某
