《第一章工具酶》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第一章工具酶（64页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第一章第一章 工具酶工具酶 主要内容主要内容 n n 一限制性核酸一限制性核酸内切酶内切酶 n n 二二其它工具酶其它工具酶 n n 1 1 DNADNA连接酶连接酶 n n 2 2聚合酶聚合酶 n n 3 3DNADNA修饰酶修饰酶 n n 4. 4. 细胞裂解酶细胞裂解酶 一限制性核酸一限制性核酸内切酶内切酶 n n 1. 1.限制性核酸内切酶的限制性核酸内切酶的定义定义与与特点特点 n n 2. 2.限制性限制性核酸内切酶的核酸内切酶的发现发现 n n 3. 3. 限制和修饰作用的分子机制限制和修饰作用的分子机制 n n 4. 4.限制性内切酶的分类限制性内切酶的分类 n n 5. 5.
2、限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名 n n 6. 6. II II型限制性核酸内切酶的基本识别特性型限制性核酸内切酶的基本识别特性 n n 7. 7.限制性内切酶的切割方式限制性内切酶的切割方式 n n 8. 8. II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 n n 9. 9.影响限制性核酸内切影响限制性核酸内切酶活性的酶活性的因素及解决方法因素及解决方法 n n 10.10.限制性内切酶的限制性内切酶的starstar活性活性 n n 11.11.其他特异性的限制酶其他特异性的限制酶 n n 12.12.DNADNA分子的片段化分子的片段化 n n 定义定
3、义： 一类能识别双链一类能识别双链DNADNA中特殊核苷酸序列，中特殊核苷酸序列， 并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖 核苷酸酶。核苷酸酶。 n n 特点：特点： n n 存在存在于任何一种于任何一种原核细菌原核细菌中中. . n n 在在特异位点特异位点上催化双链上催化双链DNADNA分子的分子的断裂断裂, ,产产 n n 生相应限制性片段生相应限制性片段. . n n 各种生物呈现特征性的限制性内切酶酶切图各种生物呈现特征性的限制性内切酶酶切图 n n 谱谱. . n n 在生物分类在生物分类, ,基因定位基因定位, ,基因重组基因重组,
4、,疾病诊断疾病诊断, ,刑刑 n n 事侦察领域极为重要事侦察领域极为重要. . 限制性限制性内切酶的内切酶的发现发现： 宿主细胞的限制和修饰作用宿主细胞的限制和修饰作用 n n 1. 1. 两种不同来源的两种不同来源的 - -噬菌体噬菌体, , K K； B B . . n n 2. 2. 能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（ K KK K株株, , B B B B 株）株） n n 3. 3. 当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下 降数千倍。降数千倍。 n n 4. 4. 一但一但 K K 噬菌体在噬菌体在B
5、B 株成功，由株成功，由B B 株繁殖出株繁殖出 K K 后代后代 ，能感染，能感染B B 株株, , K K B B 株株. .不能感染原来不能感染原来 K K株株. . n n K K K K株株 限制限制和修饰作用的分子机制和修饰作用的分子机制 n n 1 1大肠杆菌宿主细胞大肠杆菌宿主细胞 K K株株B B 株株, , 有各自的限制和修饰系有各自的限制和修饰系 统统。 n n 2. 2. 噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞K K株，株，B B株株 中中. . n n 3 3细菌利用限制和修饰系统来区分自身细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNADNA与外与外
6、 DNADNA。 n n 4. C 4. C 株株 不能产生限制性内切酶，其它来源不能产生限制性内切酶，其它来源- - 噬菌体噬菌体 可以感可以感 染染C C 株，而在株，而在 C C 株繁殖株繁殖 - - 噬菌体则在噬菌体则在 K K株株 和和B B 株株, ,受到严格的限制作用。受到严格的限制作用。 问题问题 n n 1. 1. 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有（）不太关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有（）不太 恰当。恰当。 n n A A。由作用于同一。由作用于同一DNADNA序列的两种酶构成序列的两种酶构成 n n B. B. 这一系统中的核酸酶都是这一系
7、统中的核酸酶都是II II类限制性内切酶类限制性内切酶 n n C. C. 这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNADNA进行修饰进行修饰 n n D. D. 不同的宿主系统具有不同的限制修饰系统不同的宿主系统具有不同的限制修饰系统 n n 2.2.判断下面一句话是否正确判断下面一句话是否正确 n n 限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它是通过外源限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它是通过外源DNADNA的修饰和的修饰和 对自身对自身DNADNA的限制实现的。的限制实现的。 n n 1 1）它们均有三个连续的基因位点控制，）它们均有三个连续的基
8、因位点控制，hsdRhsdR; ; hsdMhsdM; ; hsdS.hsdS. n n 2 2）hsdRhsdR 编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶-识别识别DNA DNA 分子特定位分子特定位 点，点，将双链将双链DNA DNA 切断切断。 n n （注意：（注意：DNADNA分子转化细胞：受体细胞去掉分子转化细胞：受体细胞去掉 hsdR hsdR 基因位基因位 点）点） n n 3 3）hsdMhsdM 编码产物是编码产物是DNADNA甲基化酶甲基化酶-催化催化DNA DNA 分子特定分子特定 位点的位点的碱基甲基化碱基甲基化反应。反应。 n n 4 4） hsdShsdS 表达产
9、物的功能是表达产物的功能是-协助协助限制性核酸内切酶和甲限制性核酸内切酶和甲 基化酶，基化酶，识别特殊的作用位点识别特殊的作用位点。 限制限制和修饰作用的分子机制和修饰作用的分子机制 n n 1 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA DNA 和噬菌体和噬菌体DNADNA特异特异 性保护性保护, ,封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。（封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。（修饰修饰 ） n n 2) 2) 当外来当外来DNA DNA 入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降 解。解。 （限制限制） 限制限制和修饰作用的分子机制和修饰
10、作用的分子机制 n n 3) 3) 由于降解不完全，外来少数由于降解不完全，外来少数DNA DNA 分子在宿主细胞中繁分子在宿主细胞中繁 殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被 降解。降解。 n n 4) 4) 外来少数外来少数DNA DNA 分子分子, ,虽然是外来却不被降解。但丧虽然是外来却不被降解。但丧 失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌 甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记, , 一但一但 -K -K 噬菌体在噬菌体在 B
11、B 株成功，由株成功，由B B 株繁殖出株繁殖出 -K -K 后代后代 能感能感 染染B B 株株, , 不能感染原来不能感染原来K K株株. . 限制性限制性内切酶的分类：（三大类）内切酶的分类：（三大类） n n I I I I 类，类，II II 类类, III , III 类类. . n n 2 2 I I 类，类，III III 类为限制类为限制-修饰酶。修饰酶。 n n 限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能 单位包含在单位包含在 同一酶分子中。同一酶分子中。 n n 3 3 IIII类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，类限制性内切酶
12、与甲基化酶是分离的， n n 切割位点专切割位点专 一，适合于一，适合于DNADNA重组。重组。 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 n n 限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的分类 n n 主要类型主要类型 I I型型 II II型型 IIIIII型型 n n 限制修饰限制修饰 多功能多功能 单功能单功能 双功能双功能 n n 蛋白结构蛋白结构 异源三聚体异源三聚体 同源二聚体同源二聚体 异源二聚体异源二聚体 n n 辅助因子辅助因子 ATP Mg2ATP Mg2SAM Mg2SAM Mg2 ATP Mg2ATP Mg2 SAM SAM n n 识别序列识别序列 无规律，如无规律，如E E
13、co coK K： 旋转对称旋转对称 无规律，如无规律，如EcoEcoP15P15： n n AACN6GTGC CAGCAGAACN6GTGC CAGCAG n n 切割位点切割位点 距识别序列距识别序列1kb 1kb 识别序列内或附近识别序列内或附近 距识别序列下游距识别序列下游 n n 处随机性切割处随机性切割 特异性切割特异性切割 242426bp26bp处处 n n 问题：问题： n n 1. 1.下面关于限制酶的叙述中哪些是正确的？（）下面关于限制酶的叙述中哪些是正确的？（） n n A.A.限制酶是外切酶而不是内切酶限制酶是外切酶而不是内切酶 n n B.B.限制酶在特异序列（识
14、别位点）对限制酶在特异序列（识别位点）对DNADNA进行切割进行切割 n n C.C.同一种限制酶切割同一种限制酶切割DNADNA时留下的末端序列总是相同时留下的末端序列总是相同 n n D.D.一些限制酶在识别位点内稍有不同的位置切割双链，产生黏末端一些限制酶在识别位点内稍有不同的位置切割双链，产生黏末端 n n E.E.一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA,DNA,产生平末端产生平末端 n n 2.II2.II类限制性内切酶（）类限制性内切酶（） A. A.有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列 B. B.仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 C. C.限制性识别非甲基化的核苷酸序列限制性识别非甲基化的核苷酸序列 D. D.有外切核酸酶和甲基化酶活性有外切核酸酶和甲基化酶活性
