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1、第一章 酶,DNA重组技术的基本工具,分子手术刀限制性内切酶,分子缝合针DNA连接酶,分子运输车运载体,工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,一、限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease) 这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。,+,Bam H,（一）限制性核酸内切酶的发现 （二）限制性核酸内切酶的分类 （三）II型限制性核酸内切酶的基本特性 （四）限制性核酸内切酶的命名 （五）限制性核酸
2、内切酶的消化反应,（一）限制性核酸内切酶的发现 限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源的一类酶，其功能是避免外源的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。 寄主控制的限制（restriction）与修饰 (modification) 现象： 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 由寄主控制,R/M体系： 寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶,E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 当(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，
3、被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。,R/M体系的作用：类似于免疫系统 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解 由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。,（二）限制性核酸内切酶的分类 根据酶的功能、大小和反应条件，及切割的特点，可以将限制性内切酶分为三类： 型酶、型酶、 型酶（基因工程技术中常用的是类）,I类 能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。 II
4、类 识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断。 III类 识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。 因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。,型酶： 1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。 分子量较大，反应需Mg+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。,型酶 1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。 分子量较小（105Da），只有一种
5、多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg+的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。 识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。 许多型酶切割后，可在上形成粘性末端，有利于片段的重组。,型酶 这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3端2426bp处切开，所以它的切割位点也是没有特异性的。,限制性核酸内切酶的类型,主要特性 I 型 II 型 III 型,蛋白结构,异源三聚体,同源二聚体,异源二聚体,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内或附近,距识别序列下游,随机性切割,特异性切割,24-26bp处,a.限制酶识别靶序列同DNA的来源
6、无关；,（三）II型限制性核酸内切酶的基本特性,a. 识别位点的特异性识别靶序列是唯一的，通常是由48个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。 b. 识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称的结构，以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列切割序列呈典型的旋转对称型回文结构(palindrome) 如：GAA TTC CCC GGG CTT AAG GGG CCC,c. 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,d. 核酸内切酶作用后的断裂方式 粘性末端 ：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。 平末端 两条链上的断裂位置是处
7、在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,EcoRI等产生的5粘性末端,EcoRI 37 ,退火 4-7 ,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,同裂酶（isoschizomers) 指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。 Example: 限制酶Hpa和Msp是一对同裂酶 (CCGG) ，当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时Hpa不能进行切割
8、，而Msp可以。,同尾酶（isocaudamer）指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,注 意： 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 EcoR I: 来自于Escheria coli RY13的第一个限制酶。,（
9、四）限制性核酸内切酶的命名,Hin d,属 系 株 序,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,（五）限制性核酸内切酶的消化反应,一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37）下，1h内中完全降解1 g DNA所需要的酶量。,（一）酶 切 反 应 的 基 本 步 骤,电泳,紫外分析,37 1h,加反应液,CK,M,Buffer (10X) 2.0 L ddH2O 约16.5 L DNA 0.21.0 g Enzyme 12U Volume 20.0 L,1.0kb,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,CK,M,
10、T,T,0 - 50 mM 低盐酶 100 mM 中盐酶 150 mM 高盐酶 II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： （2-1）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意： （2-2）对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切,（二）影响核酸内切酶活性的因素： 1.DNA的纯度： DNase的污染(Mg+) a.增加核酸内切限制酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶 b.扩大酶催化反应的体系（稀释）， c.延长酶催化反应时间。 加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当
11、的温度。,2. DNA的甲基化程度 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I不受影响,3. 酶切消化反应的温度： 大多数酶的标准反应温度 37度。 4. DNA的分子结构： 某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍。,（三）核酸内切限制酶标准的缓冲液 1. 氯化镁、氯化钠或氯化钾： 不正确的NaCl或Mg+浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变。 2. Tris-HCl ： 维持最适的pH值（ pH 7.4）。 3. -巯基
12、乙醇或二硫苏糖醇（DTT） ： 维持酶的稳定性。 4. 牛血清蛋白（BSA） ：维持酶的稳定性。,（四）核酸内切限制酶对DNA的消化作用 1.核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用。 2.核酸内切限制酶对DNA的局部消化 完全的酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切限制酶，对DNA的切割能达到每隔4n切割一次的水平。 局部酶切消化：不让核酸内切限制酶对大量的DNA消化完全，就可以获得平均分子量大小有所增加的限制片断产物，进行不完全的限制酶消化反应。 a. 缩短酶切的消化反应的保温时间 b. 降低反应的温度（37-4）结束酶的活性。,3.核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用 小分子量的
13、片断-少 （电泳-容易分离目的片断） 大分子量的片断-多（基因文库）,星号活性？,在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性。用*表示。,连接酶（DNA ligase）与分子的体外连接,末端核苷酸转移酶（terminal transferase） 该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），它是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化5脱氧核苷三磷酸进行53方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分
14、子加到线性DNA分子的3-OH末端。 它不需要模板，可以用含有的3-OH片段为引物，在3-OH端加入核苷酸达几百个。 它作用的底物可以是具有3-OH末端的单链DNA,也可以是具有3-OH突出末端的双链DNA,用途： 1. 催化-32P-3-脱氧核苷酸标记DNA片断的3 末端。可用于测序的终止，一位不含游离的3-OH末端。 2. 催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3-末端： 生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点。 3. 用于在平头上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。,碱性磷酸酶： 来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase BAP
15、）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase CIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5末端的磷酸根，使5-P成为5-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。,S1核酸酶： 来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。 反转录酶（reverse transcriptase） 这类酶来自于反转录病毒，它可以RNA为模板，催化合成。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。,体外连接的三种方式： 1. 用连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断 2. 用连接酶将平末端的DNA片断连接；或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(A)- poly(T)尾巴之后，再用连接酶连接。 3. 先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用连接酶连接,连接酶： 能够将DNA链上彼此相邻的3-羟基（ OH ）和5-磷酸基团（-P）
