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1、第十三章生物技术在植物育种中的应用 1 教学的基本要求 1 了解细胞工程与作物育种的原理和基本方法 2 了解作物的转基因技术的原理和基本方法 3 了解分子标记的主要类型和分子标记辅助选择育种的原理和基本方法 2 教学基本内容第一节细胞工程与作物育种一 细胞和组织培养与作物育种二 植物原生质体培养和体细胞杂交第二节作物育种的转基因技术一 转基因技术的发展现状二 转基因育种的程序三 转基因作物品种的选育四 转基因作物的生物安全性第三节分子标记辅助选择育种一 分子标记的类型和特点二 常用分子标记的原理和遗传特性三 MAS育种方法 第十三章生物技术在作物育种中的应用第一节细胞工程与作物育种 植物细胞工
2、程 plantcellengineering 是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来的一门学科 它以细胞为基本单位 在体外 invitro 条件下进行培养 繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿生产某种物质的过程 细胞工程与作物遗传改良有着密切关系 利用细胞工程技术已培育出一些大面积推广的品种 早期 哈布兰特在前人细胞学说的影响下 提出高等植物的组织和器官可以不断分割 并进一步提出了植物细胞全能性 celltotipotency 理论 植物细胞全能性是植物细胞工程的理论基础 细胞全能性是指细胞所具有的形成各种细胞类型的潜在能力 也包括植物细胞经脱分化再形成植株的能力 1904年 Han
3、ning用萝卜的胚培养 获得小植株 为组织培养的工作奠定了基础 1934年 White对番茄切段进行培养 建立了第一个活跃生长的无性繁殖系 获得了离体培养的真正成功 三年后 White又发现B族维生素对培养物的生长有重要作用 经过几年的努力 以White为主的几位科学家建立了植物组织培养 plainttissueculture 的综合培养基 成为以后各种培养基的基础 1948年 Skoog等发现腺嘌呤 生长素的比例是控制芽和根分化的决定因素之一 这一发现成为植物组织培养中控制器官形成的激素模式 Miller 1956 发现激动素比腺嘌呤更能促进芽的形成 1958年 Stewart Shautz
4、从胡萝卜根的悬浮细胞诱导分化成完整小植株 使50多年前哈布兰特提出的细胞全能性假说首次得到科学验证 这一成果大大加速了植物组织培养研究的发展 1964年 Guha等从曼佗罗花药培养出单倍体植株 1970年 Kameya等利用花粉培养获得单倍体植株 1971年 Takebe等首次从烟草原生质体获得再生植株 1972年 Carlson等获得第一个烟草种间体细胞杂种植株 至此 在愈伤组织水平 单个细胞水平 单个生殖细胞水平 原生质体水平和体细胞杂种水平都获得了完整植株 充分证实了植物细胞的全能性 植物组织培养流程示意图如下 外植体来源 外植体培养 愈伤组织 再生小植株 再生植株 植物细胞工程的应用在
5、20世纪60年代就已受到重视 但真正的应用研究在70年代才进入高潮 我国第一个用花药培养育成烟草品种 随后又育成了一些水稻 小麦新品种 经济植物的快繁与脱毒 体细胞变异的筛选 新种质的创造 细胞器的移植 DNA的导入等均对作物改良和农业生产起到了促进作用 一 植物的细胞和组织培养技术 一 培养基及其组成 1 培养基 Medium 的种类和特点常用的培养基有MS B5 White N6 KM 8p SH等 2 培养基的成分培养基中都应包括植物生长必需的16种营养元素和某些生理活性物质 通常将这些物质分为三大类 即无机营养物 有机物质和植物生长调节物质 表 表植物组织培养所需的养分和激素水 有机物
6、大量元素微量元素PH糖NFeCo 氨基酸PZnNi维生素KBAl生长素CaMnMo细胞分裂素MgCuI调节物质赤霉素S脱落酸乙烯酵母提取物椰子汁成分不定物质植物提取物水解酪蛋白蛋白胨 二 培养基的配制 1 母液的配制为了减少配制培养基时每次称量药品的麻烦 减少极微量药品在每次称重时误差 一般先配制高浓度的储备液 即母液 大量元素可配成10倍母液 使用时每配制1000ml培养基需要从母液中取100ml 配制母液时应做到分别称量 充分溶解 在混合次序上应最后加入Ca2 混合时要边加边混合 微量元素因为使用量低 一般配成100倍甚至1000倍母液 使用时每配制1L培养基从母液中取10ml或1ml 配
7、制时应注意充分溶解后再依次混合 第三种母液即铁盐 铁盐必须单独配制 若与其它元素混合易造成沉淀 一般采用鳌合铁 即FeSO4与EDTA钠盐的混合物 一般扩大200倍 EDTA钠盐须用温水溶解 然后与FeSO4液混合 在75 80 之间让其鳌合1h 使用鳌合铁的目的是避免沉淀 并使培养基能缓慢不断地供应Fe 第四种母液为有机化合物母液 主要是维生素和氨基酸类物质 这类物质不能配成混合母液 一定要分别配成单独的母液 浓度为每毫升含0 1 1 10mg 使用时根据需要量取 最后一种母液是激素 每种激素应单独配制母液 其浓度为0 1 0 5或1 0mg ml 多种激素难溶于水 配制时应注意溶解次序 I
8、AA NAA GA3 玉米素先溶于少量95 酒精 再加水定容 NAA可溶于热水或少量酒精后 再加水定容 2 4 D不溶于水 可用1mol的NaOH溶解后再定容 KT和BA应先溶于少量1molHCl中 然后定容 表一些植物组织培养基的成分 mg L 成分MS B5ORWhiteNitschSH HellerLS ER 大量元素NH4NO31650 1650 720 16501200KNO319002527 51900809502500 19001900CaCl2 2H2O440150 20075440440CaCl2 440 166 MgSO4 7H2O370246 53707501854002
9、50370370KH2PO4170 170 68 170340NH4H2PO4 340 NH4 2SO4 134 Ca NO3 2 4H2O 300 NaNO3 600 NaH2PO4 H2O 150 19 125 KCl 65 750 成分MS B5ORWhiteNitschSH HellerLS ER 微量元素KI0 830 753 320 75 10 010 83 H3BO36 2324 81 510516 20 63MnSO4 4H2O22 3 89 2525 0 122 32 23MnSO4 H2O 10 10 ZnSO4 7H2O8 6234 4310118 6 ZnSO4 4H2
10、O Zn Na2 EDTA 15Na2MoO4 2H2O0 250 251 0 0 250 1 0 250 025MoO3 0 001 CuSO4 0 2 CuSO4 5H2O0 0250 0250 10 010 025 0 030 0250 0025CoCl2 6H2O0 0250 0250 1 0 1 0 0250 0025CoSO4 7H2O 0 03 AlCl3 NiCl2 6H2O 0 03 铁盐成分MS B5ORWhiteNitschSH HellerLS ER FeCl3 6H2O 1 Fe2 SO4 3 2 5 FeSO4 7H2O27 8 27 8 27 815 27 827
11、 8Na2EDTA 2H2O37 3 37 3 37 320 37 337 3NaFe EDTA 28 1 成分MS B5ORWhiteNitschSH HellerLS ER有机物盐酸吡哆醇0 5110 010 50 5 0 5盐酸硫胺素0 110130 010 55 0 40 5烟酸0 5110 0555 0 5肌醇100100100 1001000 100 甘氨酸2 32 2脯氨酸 1381 叶酸 0 5 生物素 0 05 蔗糖3 2 3 2 2 3 3 4 2 培养基的配制以配制1L培养基为例 培养基配制方法如下 混合各成分母液 取大量元素母液100ml 微量元素母液10ml 铁盐母液
12、5ml于一个1L烧杯中 依次加入有机成分和激素 并加水至500ml 熔化琼脂 称7 8g琼脂和所需蔗糖于另一1L烧杯中 加水至500ml 待糖溶解后 加热使琼脂充分熔化 将 1 和 2 混合 搅拌均匀 补水至1000ml 调PH 一般用0 1molNaOH或1NHCl调PH至所需PH 一般PH调至5 8 但也有PH调到7 0的 不同材料的最适PH不一样 对培养基的凝固来说 PH较高时 培养基过硬 不便于培养材料吸收营养 PH过低 低到4 0以下时 培养基很难凝固 分装 将培养基分装于100ml或50ml三角瓶中 每瓶50或30ml左右 封口包装 灭菌 一般用1 1kg cm2压力 在121 下
13、灭菌15 20min 灭菌时间应根据材料掌握 时间短 灭菌不彻底 时间长 会引起培养基成分降解 放置备用 灭菌后取出培养瓶放置在培养台上 使之冷却凝固 培养瓶应平放 以免形成斜面 三 无菌操作方法 1 消毒剂在接种前 必须使材料完全无菌 这是取得植物组织培养成功的基本保证 要保证这一点 取材时应选取植物组织内部无菌的材料 从健壮植株上取材 不要有伤口 严格防止病虫 应在晴天取材 最好中午或下午取材 最好避免选用田间材料 选用无菌苗较好 非要用田间材料时 为避免消毒困难 可将材料种在大棚或生长箱里 常用的消毒剂见表 表植物材料消毒常用的消毒剂及使用方法 消毒剂使用浓度消除难易消毒时间消毒效果 m
14、in 次氯酸钠2易5 30很好次氯酸钙9 10易5 30很好漂白粉饱和溶液易5 30很好氯化汞0 1 1 0较难2 10最好酒精70 75易0 2 2好H2O210 12最易5 15好溴水1 2易2 10很好AgNO31较难5 30好抗生素4 50mg L中30 60较好 对于难消毒的材料 如有茸毛的 粗糙不平的材料等 在消毒前 一般先用肥皂水洗 自来水冲净 在70 酒精或1LHCl中浸30s 再加入消毒剂 不同的材料消毒的方式和所需时间不一样 研究者应根据不同材料确定具体消毒方案 2 无菌操作准备好接种材料用的培养基 待消毒的材料 无菌水 无菌烧杯及其它必需玻璃器皿 无菌操作工具 如剪刀 镊
15、子 解剖刀等 这些工具可用高温消毒 也可用高压高温灭菌 也可随用随消毒 70 酒精等 将超净工作台打开 让其运行10min左右 在超净工作台上打开烧杯和无菌水瓶盖 将HgCl2 0 1 倒入有待消毒材料的烧杯中 5 10min后取出另一盛有无菌水的烧杯中 无菌水冲洗3 4次 然后将材料取出接种在培养基中 封口 放入培养室培养 无菌操作时应注意下面几个问题 整过操作过程一切用具必须始终保持无菌状态 无菌操作前必须用肥皂洗手 然后用70 酒精洗手 操作时无菌器皿一旦打开 应尽量避免手再从其上横过 避免强呼吸 呼吸时应将脸移开超净台 每次重新操作都要把工具在火焰上消毒 避免交叉污染 3 无菌培养材料
16、接种后移入培养室培养 一般培养室要求非常卫生 恒温 有理想的光照控制系统 一般材料要求25 左右 晚上一般不低于20 二 细胞和组织培养与作物育种 一 体细胞克隆变异及其育种利用 在近50年中 以植物组织培养为基础的生物技术的研究与发展为植物育种提供了一些新的实验方法和手段 并且培养出一些在生产上有利用价值的品种 体细胞克隆变异指植物组织和体细胞培养物在培养过程中产生的变异 Larkin等 1981 在其综述文章中开始使用 体细胞克隆变异 somaclonalvariation 这一概念 为了区分来源于体细胞和单倍体细胞的变异 Evans将来自配子体组织的变异称为 配子体克隆变异 gametoclonalvariation 以与体细胞克隆变异区分开 对于遗传变异的分析而言 Orton为了统一术语 引进了R0 R1 R2等 分别表示再生当代 自交第一代 第二代等 至今这一概念还在广泛应用 1 体细胞克隆变异的遗传基础 1 染色体数目变异最多见的是多倍体 主要是培养基中使用了细胞分裂素 变异的大小与培养状态 年龄 原始材料的倍性及培养时期有关 研究发现 二倍体变异的频率随培养时间的延长而降
