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1、第四节第四节 细胞培养技术细胞培养技术 一、体外细胞培养技术一、体外细胞培养技术 细胞培养（细胞培养（cell culturecell culture）：）：是指从活体中取是指从活体中取 出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养， 使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。 优点：离体条件下观察细胞生命活动规律，不优点：离体条件下观察细胞生命活动规律，不 受体内环境影响可人为改变条件，进一步观察生理受体内环境影响可人为改变条件，进一步观察生理 功能的改变功能的改变 IN VITRO:IN VITRO:（离体的，即在
2、玻璃容器中）用培养细离体的，即在玻璃容器中）用培养细 胞进行的实验胞进行的实验 IN VIVO:IN VIVO:（在体内的）完整机体内进行的实验在体内的）完整机体内进行的实验 生化学家把在活细胞外进行的生化反应叫 生化学家把在活细胞外进行的生化反应叫IN IN VITROVITRO，在活细胞内发生的生化反应叫在活细胞内发生的生化反应叫IN VIVOIN VIVO 原代培养（原代培养（primary cultureprimary culture）：）： 直接取材于有机体组织的细胞进行培养直接取材于有机体组织的细胞进行培养 传代培养（传代培养（secondary culturesecondary
3、culture）：）： 把原代培养的细胞从培养瓶中取出进行培养把原代培养的细胞从培养瓶中取出进行培养 细胞体外培养所需的一般条件：细胞体外培养所需的一般条件： 适宜的培养皿适宜的培养皿 血清成分血清成分 37 537 5COCO 2 2 95 95100100湿度湿度 抗生素 抗生素 细胞系（细胞系（cell linecell line）：）： 在在细胞细胞培养中产生了具有无限增殖能力的培养中产生了具有无限增殖能力的 变种细胞，这种细胞可被无限的传代。变种细胞，这种细胞可被无限的传代。 常见的细胞系：常见的细胞系： NIH3T3NIH3T3细胞系：细胞系：19631963年取自小鼠胚胎细胞建立
4、年取自小鼠胚胎细胞建立 HelaHela细胞系：细胞系：19521952年取自人宫颈癌细胞建立年取自人宫颈癌细胞建立 二、细二、细 胞胞 融融 合合 技技 术术 （一）、细胞融合（一）、细胞融合（cell fusioncell fusion）：）：是指是指 将两个或两个以上的细胞合并形成一个细将两个或两个以上的细胞合并形成一个细 胞的过程。胞的过程。 异核体：异核体： 将两个不同类型的细胞融合，将两个不同类型的细胞融合， 可使两个不同来源的细胞核在同一可使两个不同来源的细胞核在同一 细胞中表达功能，这种细胞叫异核细胞中表达功能，这种细胞叫异核 体。常用灭活的仙台病毒或聚乙二体。常用灭活的仙台病
5、毒或聚乙二 醇（醇（PEGPEG）人工促使融合。异核体进人工促使融合。异核体进 行有丝分裂则可产生杂种细胞。行有丝分裂则可产生杂种细胞。 （二）、单克隆抗体技术（二）、单克隆抗体技术 B B淋巴细胞在抗原的刺激下增殖分化转变淋巴细胞在抗原的刺激下增殖分化转变 为浆细胞产生抗体。为浆细胞产生抗体。每一个每一个B B淋巴细胞只能接淋巴细胞只能接 受单一的抗原刺激产生特异性抗体受单一的抗原刺激产生特异性抗体, ,从单个从单个B B淋淋 巴细胞繁殖的细胞克隆可以得到均质的抗体叫巴细胞繁殖的细胞克隆可以得到均质的抗体叫 单克隆抗体单克隆抗体( (monoclonal antibody) monoclon
6、al antibody) 。 B B淋巴细胞不能在体外无限增殖淋巴细胞不能在体外无限增殖, ,故故19751975年年 k k ehlerehler和和MilsteinMilstein利用杂交瘤技术利用杂交瘤技术, ,使绵羊红使绵羊红 细胞细胞( (SRBC)SRBC)免疫后小鼠的免疫后小鼠的B B淋巴细胞和小鼠的淋巴细胞和小鼠的 骨髓瘤细胞融合骨髓瘤细胞融合, ,建立产生抗建立产生抗SRBCSRBC单抗的杂交单抗的杂交 细胞株。它既具有细胞株。它既具有B B淋巴细胞产生特异性抗体淋巴细胞产生特异性抗体 的能力的能力, ,又具有肿瘤细胞在体外无限增殖的特又具有肿瘤细胞在体外无限增殖的特 点点,
7、 ,可不断在细胞培养上清液中产生单抗。可不断在细胞培养上清液中产生单抗。 B B淋巴细胞可产生抗体但在体外不淋巴细胞可产生抗体但在体外不 易存活，小鼠骨髓瘤细胞可在体外培易存活，小鼠骨髓瘤细胞可在体外培 养生存并无限增殖。将小鼠骨髓瘤细养生存并无限增殖。将小鼠骨髓瘤细 胞与分泌某种抗体的胞与分泌某种抗体的B B淋巴细胞融合，淋巴细胞融合， 这种融合细胞即具有肿瘤细胞无限增这种融合细胞即具有肿瘤细胞无限增 殖的特性，又具有殖的特性，又具有B B淋巴细胞分泌特异淋巴细胞分泌特异 抗体的能力，称为抗体的能力，称为杂交瘤细胞杂交瘤细胞。 单克隆抗体在应用上的局限原因单克隆抗体在应用上的局限原因 1 1
8、、完整、完整IgIg分子量大分子量大, ,难以穿透肿瘤组织难以穿透肿瘤组织, ,达达 不到有效剂量不到有效剂量 2 2、鼠源性抗体异质性、鼠源性抗体异质性 3 3、半衰期短、半衰期短, ,只有只有5 56 6小时小时 4 4、肿瘤细胞抗原性调变、肿瘤细胞抗原性调变, ,抗体分子不能有抗体分子不能有 效地与肿瘤抗原结合效地与肿瘤抗原结合, ,使效价下降使效价下降 第五节第五节 细胞分子生物学研究方法细胞分子生物学研究方法 一、原位分子杂交技术一、原位分子杂交技术 DNADNA变性变性: :当溶液中的当溶液中的DNADNA分子处于高温或分子处于高温或 高高pHpH值值(13)(13)条件下条件下,
9、 ,维持双螺旋在一起的碱基维持双螺旋在一起的碱基 互补对就被破坏互补对就被破坏, ,DNADNA双链解离成两条单链双链解离成两条单链, ,这这 一过程叫一过程叫DNADNA变性。变性。 DNADNA复性复性: :当温度降低至合适温度或恢复当温度降低至合适温度或恢复 pHpH值值至中性，两条裂解的至中性，两条裂解的单链按单链按碱基互补配碱基互补配 对原则对原则重新形成双链结构重新形成双链结构, ,这一过程叫这一过程叫DNADNA复复 性性, ,又叫又叫DNADNA杂交。杂交。 核酸分子杂交核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将：按照碱基互补配对原则，将 不同来源的序列互补单链的不同来源的序列互补
10、单链的DNA/DNADNA/DNA， RNA/RNARNA/RNA，RNA/DNARNA/DNA，互补配对成双链杂交分互补配对成双链杂交分 子，这一过程叫核酸分子杂交。子，这一过程叫核酸分子杂交。 原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序 在其原位进行杂交在其原位进行杂交, ,叫原位杂交。可叫原位杂交。可 用于用于DNADNA、RNARNA定位研究。定位研究。 荧光原位杂交荧光原位杂交 （fluorescence in situ hybridization,FISHfluorescence in situ hybridization,FISH） 二、聚合
11、酶链反应技术（二、聚合酶链反应技术（polymerase chain polymerase chain reactionreaction，PCRPCR） 又叫体外基因扩增技又叫体外基因扩增技 术。利用人工合成的术。利用人工合成的 一对引物，在被扩增一对引物，在被扩增 DNADNA模板链的两端形成模板链的两端形成 双链，由双链，由DNADNA聚合酶催聚合酶催 化一对引物之间的聚合化一对引物之间的聚合 反应。反应。 具体过程：具体过程： 变性：将双链变性：将双链DNADNA加热（加热（9595）使）使 之变性，之变性，DNADNA双链变成单链双链变成单链 退火：降低温度至退火：降低温度至5656使
12、引物与使引物与 模板模板DNADNA单链结合单链结合 延伸：将温度升至延伸：将温度升至7272，在，在DNADNA聚聚 合酶作用下，在引物合酶作用下，在引物33端端 进行延伸，使原模板进行延伸，使原模板DNADNA的的 一条链变成两条链。一条链变成两条链。 三、三、反义核酸技术反义核酸技术 主要是引入主要是引入mRNAmRNA的的 反义序列或与目的基因反义序列或与目的基因 互补配对的反义基因，互补配对的反义基因， 通过它们的杂交阻遏或通过它们的杂交阻遏或 降低目的基因表达的一降低目的基因表达的一 种方法。当引入的反义种方法。当引入的反义 核酸与相应序列配对后核酸与相应序列配对后 ，用于表达目的
13、基因的，用于表达目的基因的 mRNAmRNA量大大减少，使细量大大减少，使细 胞中靶基因编码的蛋白胞中靶基因编码的蛋白 合成量也大为减少合成量也大为减少 反义技术的应用：反义技术的应用： 基因功能的研究基因功能的研究 病毒基因组功能的研究病毒基因组功能的研究 作为药物作为药物 抗肿瘤作用抗肿瘤作用 四、基因转移技术四、基因转移技术 将外源基因转移到受体菌或细胞内将外源基因转移到受体菌或细胞内 使之在细胞内实现转入基因的扩增或表使之在细胞内实现转入基因的扩增或表 达的技术。它是重组达的技术。它是重组DNADNA、基因功能研究基因功能研究 、基因治疗的关键技术之一。、基因治疗的关键技术之一。 方式
14、：方式： 转化转化 转染转染 转染技术转染技术是指将外源分子如是指将外源分子如DNADNA，RNARNA等等 导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调 控，突变分析等的常规工具，随着功能研究控，突变分析等的常规工具，随着功能研究 的兴起，其应用越来越广泛。的兴起，其应用越来越广泛。 常规转染技术可分为两大类，一类是常规转染技术可分为两大类，一类是瞬瞬 时转染时转染，一类是，一类是稳定转染稳定转染（永久转染）。前（永久转染）。前 者外源者外源DNA/RNADNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此不整合到宿主染色体中，因此 一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高
15、一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高 水平的表达，但通常只持续几天，多用于启水平的表达，但通常只持续几天，多用于启 动子和其它调控元件的分析。后者也称稳定动子和其它调控元件的分析。后者也称稳定 转染，外源转染，外源DNADNA既可以整合到宿主染色体中，既可以整合到宿主染色体中， 也可能作为一种游离体（也可能作为一种游离体（episomeepisome）存在。外存在。外 源源DNADNA整合到染色体中概率很小，大约整合到染色体中概率很小，大约1/1041/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性 标记反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系标记反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系 。 影响转染效率的主要因素有：影响转染效率的主要因素有： 1 1、细
