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1、实验一蛋白质的吸光分析测定 张亚东谭理 实验目的 通过实验使学生掌握蛋白质浓度测定的三种方法的原理 实验步骤了解改良lowry法 Coomassie亮蓝法 紫外分光光度法测定蛋白浓度的区别 优缺点以及适用范围 实验原理 改良Lowry法在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2 螯合 形成蛋白质 铜复合物 双缩脲反应 蛋白质分子中带有酚基的酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸 磷钨酸还原 生成钼蓝 钨蓝蓝色化合物 蓝色深浅与蛋白质含量成正比 利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线 测定样品中蛋白质含量 还原反应 改良lowry法的原理图 650nm Coomassie亮蓝法Coomassie亮蓝G2
2、50能与蛋白质的疏水区域结合 这种结合具有高度敏感性 G250与蛋白质形成的复合物成蓝色 在595nm处有最大吸收峰 颜色深浅与蛋白质浓度成正比关系 通过建立标准曲线可测定未知蛋白浓度 紫外分光光度法有些蛋白质组成中常含有酪氨酸 苯丙氨酸等芳香族氨基酸 在紫外光280nm处有最大吸收峰 故可根据280nm处的吸光度的大小来测定这类蛋白质的含量 在生物样品中还可能会含有核酸等成分 在280nm处也有吸收 它的最大吸收峰在260nm可通过经验公式排除核酸的影响蛋白质浓度 1 45A280 0 74A260 波长260280 实验步骤 改良Lowry法 混匀后置于50度水浴中保温10分钟 冷却室温放
3、置10分钟立即混匀 置于50度水浴中保温10分钟 冷却后在650nm处比色 改良Lowry法蛋白质浓度测定 制备标准曲线 根据测定管的OD650nm值计算未知蛋白质浓度 Coomassie亮蓝法 摇匀 室温静置3分钟 以第六管为对照 于595nm波长比色 读取吸光度 制备标准曲线 根据测定管的OD595nm值计算未知蛋白质浓度 紫外分光光度法取待测样品稀释液 以蒸馏水为对照 在紫外分光光度计上分别测定OD280nm和OD260nm的吸光度值 根据经验公式计算蛋白浓度蛋白质浓度 1 45A280 0 74A260 实验仪器 实验讨论和注意事项 比色法是常用的测定浓度的方法 其关键点在于标准曲线的制备一定要精确 标准样品的配置浓度是否精确直接影响实验的结果 因此要正确掌握加样枪 移液管的操作 保证标准样品配置的准确 对于分光光度计的使用要正确掌握 注意调节波长 正确的进行仪器的调试和测定 保证结果的准确
