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1、1 临床生物化学临床生物化学实验室实验室 基本技术与管理基本技术与管理 2 教学目标标和要求 掌握光谱谱分析中的对对比法、摩尔吸收系数法、荧荧 光法和比浊浊法测测定的方法原理，在生化检验检验 中的 应应用及注意事项项；区带电带电 泳的原理、应应用及影响 因素；离子选择选择 性电电极法测测定的原理和注意事项项 。 熟悉离心技术术，其它电电泳技术术和层层析技术术中的 HPLC及亲亲和层层析的原理和应应用；免疫分析技术术、 生物传传感技术术的概念和应应用原理。 了解光谱谱、层层析等常用生化技术术的应应用原理和方 法，生物芯片技术术的概念和应应用原理。 3 本 章 主 要 内 容 色谱检验技术 电泳技
2、术 免疫学检验技术 电化学分析技术 生物传感技术 光谱检验技术 4 第一节第一节 光谱检验技术光谱检验技术 5 v利用各种化学物质都具有发射、吸收 或散射光谱谱系的特征，以此来确定 物质性质、结构或含量。 v根据物质对光谱响应特征的不同，可 把光谱检验技术分为发射光谱分析技 术、吸收光谱分析技术和散射光谱分 析技术三大类。 v在临床生物化学检验中，光谱分析是 一类十分重要的技术，应用极为广泛 。它既可以研究物质的结构分析，也 可以对特定物质进行定性或定量的分 析。 6 一、吸收光谱分析法一、吸收光谱分析法 v吸收光谱是指波长连续分布的光透过 物质时，某些波长的光被物质吸收而 产生的暗线或暗带组
3、成的光谱。它是 物质定量测定的基础。 7 一、吸收光谱分析法一、吸收光谱分析法 v利用吸收光谱对物质进行定量的技术 就是吸收光谱分析法，是实验室最常 用的分析技术之一。它操作简便、快 速，线性范围较宽，应用广泛。 v目前最常应用的技术有可见-紫外光光 度分析和原子吸收分光光度法。 8 可见紫外光分光光度法可见紫外光分光光度法 v1检测原理 v可见-紫外光分光光度法的理论基础基 于朗伯比尔定律。 v可见-紫外光区一般是指波长从200nm 至760nm范围内的光，其中小于 400nm的是紫外光。 v该分析是根据物质的分子对光的吸收 特性进行物质定量分析或分子结构分 析的方法。 9 v2.测定方法
4、在可见-紫外分光光度法中，通常在测 定未知样品浓度的同时，与同一个已 知浓度的标准物作比较，可以利用以 下公式计算而求出其浓度,即比较法。 v因为As= KCsb Ax= KCxb v其中A为吸光度， C为溶液的浓度， 其下标s、x分别表示属标准物、待测 物；k为常数，b为比色杯的光径。 10 v用比较法定量时，选用的标准品溶液 的浓度若接近于样品溶液的浓度，可减 少误差。 11 若将一系列浓度不 同的标准液按照一 定操作过程显色后 ，分别测吸光度， 以吸光度为纵坐标 ，浓度为横坐标绘 制标准曲线。从标 准曲线找出相对应 的待测样品的浓度 ，即标准曲线法。 12 4 4. .分光光度法的建立分
5、光光度法的建立 首先要确定显色液的最大吸收峰。 v在其它条件不变的情况下，在一定范围 内以一定的步长调整波长，并记录相应 波长时的吸光度，然后以波长为横坐标 ，吸光度为纵坐标作图，就是该反应液 的吸收光谱（如图2-1 ），在吸收曲线 上的峰称吸收峰，其对应的波长称最大 吸收波长，即可确定该显色液的测定波 长。 13 图图2-12-1吸收光谱图吸收光谱图 波长的选择可按“吸收最大，干扰最小”的原则进行。 14 二、发射光谱分析法二、发射光谱分析法 v临床生物化学检验常用的有荧光 分析法和火焰光谱法。 v由于火焰光谱法目前应用越来越 少，在这里就不再详细描述。 15 荧光分析法（荧光分析法（flu
6、orometryfluorometry） v有些物质物质受到有较高能量的光（ 如紫外光）照射时，在吸收了某些波 长的光后，会发射出不同波长和不同 强度的光，照射停止，发光亦随之消 失，这种光称为荧光。 16 荧光分析法（荧光分析法（fluorometryfluorometry） v在一定条件下，荧光物质的浓度愈大 ，发射的荧光强度也愈强。 v对荧光物质进行定量测定的方法称为 荧光分析法。 v荧光分析的灵敏度比分光度法高，通 常可达10-13g/L,对特定物质甚至可达 到10-15g/L。 17 荧光分析技术的应用荧光分析技术的应用 v荧光物质的最大吸收波长和最强荧光 波长是鉴定物质的依据。该法
7、灵敏度 高、取样量少，因此被广泛应用于各 领域，在临床生物化学检验中主要用 于糖类、胺类、甾族化合物、DNA与 RNA、酶与辅酶、维生素等物质的分 析。 18 第二节、电化学分析技术第二节、电化学分析技术 19 v电化学传感器在临床生化分析的应用 中占据着主导的地位。其原理是将电 极浸入待测溶液中组成原电池，其中 一支电极的电极电位与待测离子的活 度有关，此电极称为指示电极；另一 支电极是电位已知并且恒定的所谓参 比电极,目前最常用的参比电极有甘汞 电极和银-氯化银电极。这里主要介绍 离子选择电极分析法。 20 离子选择电极法的原理离子选择电极法的原理 v离子选择电极分析法（ion selec
8、tive electrode，ISE）是利 用电极电位和离子活度的关系来 测定被测离子活度的一种电化学 分析法。 21 离子选择电极法的原理离子选择电极法的原理 vISE法的核心是指示电极上带有对被 测离子选择性响应的敏感膜，膜的一 面与被测离子的溶液相接触、另一面 则与电极内所充的一定活度的被测离 子溶液和内参比电极接触，膜内外的 离子活度的差异引起离子从高浓度向 低浓度迁移，从而产生电位改变，其 数值可在等电流的条件下测定。 22 ISEISE的特点的特点 v选择性好:多数情况下共存离子的干 扰小，组成复杂的试样往往不需分离 处理即可直接测定； v灵敏度高：可达10-510-8mol/L,
9、 v 线性范围宽 v溶血、脂血及黄疸不影响测定，对 有色、浑浊溶液都可进行分析； v设备简单，分析速度快，易于自动 化，标本用量少，应用范围广。 23 离子选择性电极的分类离子选择性电极的分类 v离子选择电极最常用的电极有以下几 种。 v（一） 玻璃膜电极 v（二）气敏电极 v（三） 酶电极 24 v由于离子选择电极在技术方面的优越性 和制造技术的进步，电极的稳定性和寿 命大大增强，有的电极还是免维护的， 因此，最新临床化学分析系统倾向于多 电极组合和智能化。电解质、血气和酶 电极（主要是葡萄糖、尿素和乳酸传感 器）集中在同一台设备中，犹如一个小 型实验室。利用这种设备，同一标本一 次便可以完
10、成所有的测试。同时也可以 有选择地做其中的某一项或几项测定。 离子选择性电极的发展 25 第三节第三节 电泳技术电泳技术 26 v 电泳技术应用广泛，在生物化学实验 技术中占有重要地位，主要用于蛋白 质、核酸等的分离、鉴定和定量。 27 电泳技术的原理电泳技术的原理 v原理：带电粒子在电场中的移动现象称 为电泳(Electrophoresis)。带负电荷的 粒子向电场的正极移动；带正电荷的粒 子则向负极移动。各种物质由于所带净 电荷的种类和数量不同，因而在电场中 的迁移方向和速度不同。利用物质的这 种性质可以对物质进行分离和鉴定。普 通电泳设备简单，操作方便，分辩率较 高，已成为医学检验中不可
11、缺少的常用 技术。 28 电泳类型及应用电泳类型及应用 v电泳的分类方法很多，在这里主 要根据支持介质分为纸电泳、薄层 电泳（醋酸纤维素薄层电泳）、琼 脂糖（琼脂）电泳、淀粉胶电泳等 。下面介绍几种常用的电泳类型及 其应用。 29 （一）（一）. . 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳（ cellulose acetate electrophoresiscellulose acetate electrophoresis） v醋酸纤维素是将纤维素的羟基 乙酰化而形成的纤维素醋酸酯 ，由它制成的薄膜称为醋酸纤 维素薄膜。 30 （一）（一）. . 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳（ cell
12、ulose acetate electrophoresiscellulose acetate electrophoresis） v它具有分辩力好，对蛋白质吸附极少 ，拖尾现象轻微；不吸附染料，对区 带周围的染料能完全洗去，不干扰测 定；样品需要量少、介质又可以透明 后定量扫描等优点。 v临床生物化学上分离血清蛋白、糖蛋 白、脂蛋白、血红蛋白、甲胎蛋白及 同工酶等大分子物质。 31 （二）（二）. . 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（ polyacrylamide gel polyacrylamide gel electrophoresis,PAGEelectrophoresis,PAGE
13、） v聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝 胶，由丙烯酰胺单体和交联剂在催化 剂和加速剂的作用下聚合而成三维网 状结构的凝胶。 32 v聚丙烯酰胺凝胶兼有电泳支持介质及 分子筛的功能，大大提高了分离能力 ，是目前分辨率最高的电泳支持介质 。它能精细地分离各种蛋白质组分。 在蛋白质的电泳中，为了使被测物质 的泳动速率的大小完全取决于分子量 ，在电泳系统中加入一定量的十二烷 基硫酸钠(SDS)以消除或减少电荷对 蛋白质移动的影响。 33 v聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于：蛋白 质分子的分离鉴定、蛋白质分子量的 测定、核酸的分析（非解离体系）、 核酸的序列测定（解离体系）以及尿 蛋白电泳等诸多方面，是目前最
14、常用 的电泳技术之一。 34 （三）等电聚焦电泳（三）等电聚焦电泳 v两性电解质的载体，在电场中可以形 成一个连续的pH梯度。蛋白质具有多 解离基团，在不同pH下处于不同的荷 电状态。当周围环境的pH值低于蛋白 质的等电点（pI）时，蛋白质呈正电 性，在电场中向负极移动，在移动过 程中，正电性逐渐减弱，直至零，此 时蛋白质移到了pH等于pI的区域，不 再移动。 原理 35 v反之，溶液pH高于蛋白质的等电点时 ，蛋白质呈负电性，在电场中向正极 移动，最终也将停在pH等于pI处。只 有当溶液的pH等于蛋白质的等电点， 为电中性，蛋白质在电场中才不移动 。利用蛋白质的这个性质，将其放在 由两性电解
15、质形成的pH梯度中，可以 依不同蛋白质的等电点不同，达到分 离的目的。 等电聚焦电泳等电聚焦电泳 36 等电聚焦电泳的优点等电聚焦电泳的优点 v等电聚焦电泳的分辩率很高，可达 0.001pH单位，主要用于样品组分较 复杂但pI不同的蛋白质的分析，如血 红蛋白和同工酶的分析。 37 第四节、常用免疫分析技术第四节、常用免疫分析技术 38 v随着单克隆抗体的开发和使用、各种 标记技术的发展使得免疫学进入了一 个新的时期。由于免疫分析技术具有 特异性好、快速、灵敏度高等，使得 其应用范围十分广泛，在临床生物化 学中可以对内分泌激素、蛋白质、多 肽、核酸、神经递质、受体、肿瘤标 志物、血药浓度等血清微
16、量物质进行 定量测定。 39 一、免疫比浊分析一、免疫比浊分析 v带有小颗粒的悬浮液和胶体溶液都具 有向四面八方散射入射光线的性质， 散射光谱分析法就是利用悬浮颗粒的 混浊液的散射光强度或对入射光减弱 的原理进行定量分析的方法。其方法 原理类似比尔定律，常规应用主要有 两类：透射比浊法和散射比浊法。 40 ( (一一) )散射免疫比浊分析散射免疫比浊分析 v散射比浊法（nephelometry）是指 一定波长的光沿水平轴照射，通过溶 液时遇到抗原抗体复合物粒子，光线 被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏 转的角度与发射光的波长和抗原抗体 复合物颗粒大小和多少密切相关。 41 v散射光的强度与复合物的含量成正比 ，即待测抗原越多，形成的复合物越 多，散射光强度越强。散射比浊法分 析是免疫比浊分
