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1、病理学技术 ThetechniqueofPathology 哈尔滨医科大学病理教研室金晓明 序 病理学的理论和技术被视为一辆车的两个车轮 缺一不可 互为依存 互相促进 两者的结合决定病理学的发展 病理学的技术主要体现在几个结合上1 传统病理学技术与现代生物新技术相结合2 宏观 脏器 组织 细胞 超微与分子基因不同层次技术相结合3 形态 机能与代谢变化相结合4 定性 定位与定量观测相结合5 实验研究技术与临床应用技术相结合6 技术的基本原理与具体方法相结合7 基本技术知识与作者实践经验相结合 病理学的发展与使用的工具和方法的更新密切相关1 用解剖刀剪等进行尸体检查 开展了器官病理学2 显微镜发明
2、百年之后 建立了细胞病理学3 电子显微镜的问世 发展了超微病理学4 免疫组织化学促进了免疫病理学的发展5 分子生物学带动了分子病理学的兴起6 计算机及其网络的应用 将病理学走向信息病理学时代 传统病理学技术 传统的Formalin固定 石蜡切片和HE染色技术仍是病理学的基本技术 大量应用与基础和临床病理学日常工作中 保证和提高常规质量和现代设备水平十分重要 第一章 病理解剖技术一 病理解剖的意义病理解剖技术是病理学的基础之一 是病理学不可分割的一部分 通过病理解剖收集病理教学及科研资料是其中一个途径 大量病理资料的积累促进了医学的发展与进步 病理解剖是通过解剖尸体观察和发现死者器官 组织的病理
3、变化 找出主要病变 分析判断直接死亡的一个重要方法 二 病理解剖室的设备和器械1 设备 1 解剖室的设计要求最好位于太平间 室内面积要大 必须有两个门 地面用水磨石 四周有排水沟或地漏 室内通风好 有消毒室 男女更衣室 浴室等 2 解剖台的设计高低和大小要合适台面可用水磨石或不锈钢有条件可购置能够升降的解剖台解剖台可带有抽气的功能等 水磨石台面的解剖台 水磨石台面的解剖台 不锈钢台面的解剖台 不锈钢台面的解剖台 病理解剖器械 2 器械 3 清洁 消毒和个人保护1 病理解剖室的清洁和消毒2 病理解剖器械的清洁和消毒3 个人保护等 三 病理解剖的方法和步骤1 病理解剖前的准备主要办理一切手续 非常
4、重要 2 体表检查 体表检查 尸斑 尸僵 3 胸腹腔检查1 切口2 腹腔检查3 胸腔检查 腹腔有渗出液 心包积液 血液 气管周围血液 液体称量 4 内脏器官的取出及检查一般有两种方法 1 各脏器分别取出法是病理解剖最常用的方法2 多脏器联合取出法此法比较简单 可保持各器官的完整性 心脏 表面充血 绒毛心 双肺和支气管 肝脏 表面有结节 胰腺 出血改变 肠管 出血 脑 脑干出血 第二章病理大体标本的制作一 大体标本的收集 取材 固定和保存1 大体标本的收集通过尸体解剖和活体组织 包括外科手术切除标本和活体组织穿刺标本 检查时发现并收集 2 大体标本的取材 取材室条件 通风要好 必须有排风设备 固
5、定的组织取材前要用流水充分冲洗 排水要远离住宅区等 不同器官的取材和固定不同 1 实质性的器官 如肝 脾等要注意 实质器官不容易被固定液所穿透 肝癌 肝癌 肝癌 肝癌 2 空腔器官 如胃 肠等取材时要看全层 保持粘膜 肌层和浆膜全层的组织 胃癌 呈菜花状 切面的形状 胃癌 溃疡型 切面的形状 切面的形状 浸润性至浆膜 溃疡型胃癌 溃疡型胃癌 切面的形状 浸润性至浆膜 3 肺肺组织比较疏松 固定液容易渗透 肺组织的取材要清楚的了解各叶肺组织所伴随的支气管 A 主支气管B 叶支气管 肺和气管周围的淋巴结 肺癌肺门型 肺癌肺门与周围之间 肺癌周围型 肺癌空洞型 4 其它类型外科手术标本常见 乳腺癌子
6、宫颈癌肠癌卵巢肿瘤等 乳腺癌 乳腺癌 乳腺癌 乳腺癌 子宫颈癌 子宫颈癌 子宫颈癌 子宫颈癌 切面 3 大体标本的固定1 固定的目的 将受检组织尽快地侵入固定液内 使组织和细胞的固有成分迅速凝固 防治自溶和腐败 使其保持与生活状态有相似的结构 以利于切片和观察 2 固定液的选择 A 甲醛 Fomaldehyde 又称福尔马林 其浓度在4 它是一种还原剂 极易挥发 散发出强烈的刺激性气体 使人流鼻涕 流眼泪 呼吸道有异物感 B 95 酒精 乙醇 除具有固定组织的作用外 尚有脱水作用 3 固定液的特性甲醛固定液渗透力强 固定均匀 对组织收缩较小 并能增加组织韧性的优点 而且可以保存组织内的脂类物质
7、 对组织的主要作用为硬化和防腐 酒精可以保存组织内的糖类物质及尿酸结晶 不过 它常使组织明显收缩 且使脂类物质溶解 4 大体标本的脱水 包埋和切片为能制成满意的切片 固定后的组织还要经过脱水 透明 浸蜡及包埋等一系列程序 1 脱水 目的是将固定了的组织内水分除去 以便使切片时的支撑物 石蜡 充分进入组织内 常用的是酒精 2 透明 目的是使能与石蜡结合溶解的媒介剂进入组织 进而将不能与石蜡结合的脱水剂置换出来 并使组织透明 常用的是二甲苯 3 浸透和包埋 可使组织具有一定的硬度和韧度 便于切成薄的切片 常用的石蜡溶点为60 62 有时为保存更多的抗原成分 可采用低溶点石蜡 48 50 4 切片切
8、片机类型 旋转式切片机滑动式切片机 旋转式切片机 5 HE HematoxinEosin HE 染色1 苏木素染色配方 苏木素1g纯酒精10ml钾明矾20g蒸馏水200ml氯化汞0 5g2 伊红染色配方 伊红0 5 1g蒸馏水99ml HE染色法 1 苏木素染色5 7分钟 2 自来水冲洗多余的染液 3 1 盐酸酒精分化数秒钟 使细胞核呈紫蓝色4 自来水中充分洗涤 5 1 氨水中数秒 至返蓝 6 自来水中至蒸馏水冲洗 7 1 的伊红染色 3分钟左右 结果 细胞核呈紫蓝色 细胞浆呈粉红色 基底膜 胶原纤维及肌纤维呈粉红色 HE切片 第三章特殊染色HE染色虽是一种快速 经济 且易掌握的方法 但它不能
9、回答病因学 Z组织发生及发病机制等方面的许多问题 而特殊染色可以协助解决病理诊断问题 目前市场上有配制好的特殊染色试剂 介绍常用的几种特殊染色1 脂肪染色主要用于心 肝 肾的脂肪变性 动脉粥样硬化 以及因脂肪栓塞导致的死亡病例鉴定等 1 试剂配制 苏丹染液苏丹III或苏丹IV0 5g 70 乙醇250ml 丙酮250ml 2 染色方法 1 标本常规甲醛固定后流水冲洗12h 2 用滤纸吸干标本表面的水分 把标本放入苏丹III染液中浸泡30min 3 用70 乙醇分化 以脂肪组织呈橙黄色 其它组织不着色为佳 4 水洗后浸存在5 甲醛液中 为了防腐可加入适量的防腐剂 肝脂肪变 苏丹III染色 2 过
10、碘酸 periodicacid schiff染色 即PAS染色此技术主要显示糖原 在淀粉酶消化对照下 中性粘液物质 基底膜 霉菌和寄生虫等 1 schiff氏试剂的配方 1 将200ml蒸馏水煮沸 2 冷却至90 时 慢慢加入碱性复红1g 3 搅拌并煮沸5分钟使其全溶 4 冷却至50 时过滤 并加入1N盐酸20ml 5 冷却至25 时 再加入无水亚硝酸钠1g并搅拌匀 6 置入遮光瓶内并放入在4 冰箱内保存备用 2 PAS染色方法 1 1 过碘酸水溶液染10分钟 使含有乙二醇的化合物氧化形成醛基 2 蒸馏水洗去过碘酸 3 schiff氏试剂反应15分钟 使醛基和schiff氏试剂结合 形成紫红色
11、产物 4 0 5 亚硝酸钠 NaHSO3 处理三次 每次2分钟 5 流水冲洗5 10分钟 6 用苏木素染色液复染细胞核 7 水洗或1 盐酸酒精分化 3 结果 细胞核呈蓝色 基底膜呈红色 胶原纤维 肌纤维及细胞浆呈红色 过碘酸 Schiff反应 糖元及其他PAS反应阳性物质呈红色 细胞核呈蓝色 PAS 念珠菌 PAS染色 附 AB PAS法 阿尔辛蓝过碘酸雪夫染色法 结果 中性粘液物质呈红色 酸性粘液物质呈蓝色 中性和酸性粘液的混合物质呈紫色 阿尔辛蓝 阿尔辛黄法 常用于黏液上皮肿瘤的鉴别诊断 阿尔辛蓝过碘酸雪夫反应 是显示中性和酸性黏液物质的有效方法 HID AB 高铁二胺奥新蓝法 AB PA
12、S 3 六胺银 PASM 染色在肾脏活体组织检查和一些真菌感染的组织选用此方法 1 PASM染液的配方 2 硝酸银水溶液3ml 3 六次甲基四胺液25ml 5 硼砂2ml 注 2 硝酸银配制胺溶液 染色时间40分钟 温度55 60 随时镜下观察便于控制 2 PASM染色法 1 1 过碘酸水溶液内染10分钟 2 自来水冲洗 蒸馏水冲洗 3 入5 铬酸水溶液40分钟 出此溶液后用1 亚硫酸钠除掉铬酸 4 自来水洗数次 蒸馏水洗3 4次 5 入六胺银染液 50 60 40分钟 20分钟后 每5分钟镜下观察一次 蒸馏水洗四次 6 入0 2 氯化金水溶液1 2分钟 蒸馏水洗三次 7 入5 硫代硫酸钠水溶
13、液1 2分钟 蒸馏水洗数次 8 复染HE 脱水 透明 封片结果 底膜呈黑色 网状纤维呈黑色 细胞核呈蓝色 背景呈粉红色 PASM染色 PASM染色 PASM PASM 附 PASM对真菌的染色真菌 fungus 又称霉菌 其种类较多 真菌的基本结构成分是含有较多的粘多糖和蛋白质 1 试剂的配制 1 六次甲基四胺 硝酸银原液 简称六胺银原液 3 六次甲基四胺水溶液100ml 5 硝酸银水溶液5ml 2 六胺银硼砂染色液 六胺银原液25ml 蒸馏水25ml 5 硼砂水溶液2ml 3 核固红染液 核固红0 1g 硫酸铝5g 蒸馏水100ml 4 亮绿染色液 亮绿0 2g 蒸馏水100ml 冰醋酸0
14、2ml 2 染色步骤 1 5 铬酸水溶液氧化1小时 流水洗2分钟 蒸馏水洗2次 2 浸入1 亚硫酸钠水溶液除掉铬酸1分钟 流水洗5分钟 蒸馏水洗3次 3 浸入六胺银硼砂液染色1 1 5小时 40 50 温箱内 至切片呈浅棕色 蒸馏水3次 4 用0 2 氯化金水溶液调色3分钟 蒸馏水稍洗 5 核固红染色细胞核10分钟 流水洗 蒸馏水洗 6 亮绿染色液30秒 用蒸馏水快速稍洗 7 无水乙醇脱水 二甲苯透明 中性树胶封固 结果 真菌均呈黑色 菌丝和孢子呈黑褐色 细胞核呈红色 背景呈淡绿色 念珠菌 假菌丝 新生隐球菌性脑膜炎 4 淀粉样物质染色 介绍刚果红染色 淀粉样物质是一种嗜伊红性物质 性质属于糖
15、蛋白成分 组织出现此物质称为淀粉样变性 1 试剂配制 1 刚果红染色液 刚果红1g 蒸馏水100ml 2 Harris苏木素染色液 2 染色步骤 1 苏木素染色液浸染2分钟 2 0 5 盐酸乙醇分化数秒钟 3 流水洗 蒸馏水洗2次 4 刚果红染色液中25分钟 5 无水乙醇迅速脱水2次 6 二甲苯透明 中性树胶封固 结果 淀粉样物质呈红色 细胞核呈蓝色 刚果红染色 5 Mallory三色染色法 属于结缔组织复合染色法 1 试剂配制 1 重铬酸钾液 重铬酸钾2 5g 醋酸5ml 蒸馏水95ml 2 苯胺蓝橘黄G液 苯胺蓝0 5g 橘黄2g 磷钨酸1g 蒸馏水100ml 3 酸性复红液 酸性复红0
16、5g 蒸馏水100ml 2 染色步骤 1 重铬酸钾液10分钟 2 流水洗2分钟 蒸馏水洗2次 3 酸性复红液2分钟 蒸馏水稍洗 4 苯胺蓝液20分钟 95 乙醇快速分化 5 直接用无水乙醇脱水 二甲苯透明 中性树胶封固 结果 胶原和网状纤维呈蓝色 软骨 粘液 淀粉样变性物质呈淡蓝色 神经胶质纤维 肌纤维和酸性颗粒呈红色 髓鞘和红细胞呈橘红色 特点 利用酸性复红 苯胺蓝 橘黄G这三种染料对结缔组织和非结缔组织进行着色 Mallory 6 Masson三色染色法1 试剂配制 1 Masson复合染色液 碱性复红1g 丽春红2g 橘黄G2g 0 25 醋酸300ml 2 亮绿染色液 亮绿SF0 1g 0 2 醋酸100ml 2 染色步骤 1 Masson复合染色液5分钟 2 0 2 醋酸水溶液稍洗 3 5 磷钨酸5 10分钟 4 0 2 醋酸水溶液浸洗2次 5 亮绿染色液5分钟 6 0 2 醋酸水洗2次 7 无水乙醇脱水 二甲苯透明 中性树胶封固 结果 细胞核呈红色 基底膜 胶原纤维呈蓝绿色 免疫复合物呈红色 适用于脑垂体 上皮 甲状腺 神经的正常和肿瘤组织 Masson 肾小球 左 HE染
