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1、第七章 病毒 第一节概述 病毒的发现病毒的特点和定义 病毒的发现 18代埃及王朝时代 1500年BC 浮雕刻有一条萎缩腿的祭司 脊髓灰质炎 古希腊哲学家亚里斯多德早在公元前四世纪描述狂犬病症状 公元前2 3世纪 我国和印度都记载过天花 17世纪西欧的郁金香热 花叶病毒使花瓣呈美丽的杂色 病毒的发现 此后 许多学者陆续发现了各种植物病毒 动物病毒和细菌病毒 噬菌体 病毒的发现人类初步认识病毒的存在 是在19世纪末期 1886年 德国的A Mayer在荷兰发现烟草上出现深浅相间的绿色区域 烟草花叶病毒 随后证实其具有传染性 1898年 荷兰学者M W Beijerinck独立进行了烟草花叶病病原体
2、的研究 首次提出其病原是一种 传染性的活性液体 或称 病毒 从此病毒学的历史被揭开 病毒的发现 1935年美国的Stanley首次提纯并结晶了烟草花叶病毒 tobaccomosaicvirus TMV 认识有了大突破 接着 Bawden等进一步揭示了TMV的化学本质并不是纯蛋白 而是核蛋白 1940年德国的Kausche等首次在电镜下观察到TMV的杆状外形 一 病毒的特点和定义 病毒的特点病毒的定义 病毒的特点形体极其微小 电镜下才能观察 没有细胞构造 其主要成分是核酸和蛋白质 每一种病毒只含有一种核酸 DNA或RNA 既无产能酶系 也无蛋白质合成系统 在宿主细胞协助下 通过核酸的复制和核酸蛋
3、白质装配的形式进行增殖 在宿主的细胞内营专性寄生 在离体的条件下 能以无生命的化学大分子状态存在 并可形成结晶 对一般抗生素不敏感 但对干扰素敏感 病毒的定义 病毒是一种生物实体 其基因组是能利用细胞的合成系统在活细胞内复制 并合成能将病毒基因组转移到其他细胞中去的特殊颗粒的核酸分子 DNA或RNA 第二节病毒学研究的基本方法 病毒的分离与纯化病毒的测定 一 病毒的分离与纯化 标本的采集与处理标本接种与感染表现 标本的采集与处理足够量的活病毒采集标本的种类确定最适采集时间标本处理的方法 加抗菌素除菌等方法 标本处理后应立即接种 数小时内可置50 中性甘油内4 保存 较长时间冻存标本最好置 20
4、 以下或干冰保存 标本接种与感染表现标本接种于何种实验宿主以及选择何种接种途径主要取决于病毒的宿主范围和组织嗜性 同时应考虑操作简单 易于培养 所产生的感染结果容易判定等要求 噬菌斑 将噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板 经过一定时间培养 在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域 即为噬菌斑 噬菌斑 plaque 下层培养基 双层培养基 敏感菌 上层培养基 噬菌体稀释液 培养 噬菌斑 噬菌斑 敏感菌菌苔 噬菌斑 plaque 概念 噬菌斑是指在宿主细菌的菌苔上 噬菌体使菌体裂解而形成的空斑 Localizedareasofcellulardestructionandlysiscausedbyvir
5、usinfectionarecalledplaques 应用 1 噬菌体定量计数2 噬菌体的鉴定 空斑和蚀斑 在动物细胞培养物上的与噬菌斑类似的空斑 称为蚀斑 因为受肿瘤病毒感染 蚀斑 空斑 若动物病毒标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理 病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区 即蚀斑 空斑 枯斑 植物病毒接种敏感植物叶片可产生坏死斑 称为枯斑 枯斑 包涵体 inclusionbody 在病毒感染寄主细胞时 对被感染细胞进行染色 则可观察到细胞内有明显区别的大小不等的颗粒状结构体 这些结构体总称为包涵体 包涵体 包涵体可分为两类 一类是在细胞内增殖的病毒颗粒及集落 如腹股沟淋巴肉芽
6、病毒和天花病毒的包涵体 另一类是由于病毒感染后 在细胞产生的一种反应生成物 例如由狂犬病病毒而引起狗脑神经细胞中的包涵体 包涵体 包涵体有的在细胞质中 腹股沟淋巴肉芽瘤 天花 狂犬病等 有的在细胞核内 特称为核包涵体 包涵体 是病毒的聚集体 是病毒的合成部位 是病毒蛋白和病毒感染有关的蛋白质 病毒纯化 病毒纯化的标准病毒纯化的方法 病毒纯化的标准 病毒纯化有二个标准 由于病毒是有感染性的生物体 所以纯化的病毒制备物应保持其感染性 由于病毒具有化学大分子的属性 病毒毒粒具有均一的理化性质 所以纯化的病毒制备物的毒粒大小 形态 密度 化学组成及抗原性质应具有均一性表现 病毒纯化的方法 根据病毒的基
7、本理化性质建立纯化的方法 毒粒的主要化学组成是蛋白质 鉴于病毒的高蛋白含量 故可利用蛋白质提纯方法来纯化病毒 如盐析 等电点沉淀 离子交换等 毒粒是由许多大分子组成 离心时它们比细胞蛋白沉降更快 而且许多病毒都有较高的浮密度 所以超速离心技术广泛地用于病毒纯化 一般可在10000 100000g的离心场中1 2h沉降 病毒纯化的方法 病毒的测定 病毒的物理颗粒计数 电镜下直接计数 病毒的感染性测定 病毒的感染性测定 病毒的感染单位 能够引起宿主或宿主细胞一定特异性反应的病毒最小剂量 IU 病毒的效价 待测样品中所含病毒的数量 通常以单位体积 ml 病毒悬液的感染单位数目来表示 IU ml 噬菌
8、斑数 试样中噬菌体数 第三节毒粒的性质 毒粒的形态结构毒粒的化学组成 一 毒粒的形态结构 病毒的大小和形状毒粒的壳状结构 病毒的大小和形状 大小 病毒的大小常用纳米 nm 10 9 来度量 病毒大小从10 300nm之间 通常大小在100nm左右 绝大多数病毒是能通过细菌滤器 须用电镜才能观察到其具体形态和大小 球状 球状病毒 或多面体病毒 动物病毒多为球状 杆状 杆状病毒 包括棒状或线状 植物病毒多呈杆状 蝌蚪状 蝌蚪状病毒 细菌病毒也即噬菌体多呈蝌蚪状 病毒的大小和形状 Fig 1B SizesandShapesofViruses AnimalDNAViruses Tobaccomosai
9、cvirus TMV 形状 病毒大小 牛痘苗病毒 传染性浓泡皮炎病毒 腮腺炎病毒 T偶数病毒 疱疹病毒 大蚊病毒 流感病毒 烟草花叶病毒 腺病毒 多瘤病毒 脊髓灰质炎病毒 1微米 典型病毒粒子的构造 衣壳 capsid 核心 genome 衣壳粒 capsomere 衣壳 核酸 包膜 envelope 糖蛋白 核衣壳 nucleocapsid 毒粒的壳状结构 病毒粒子的基本结构 capsid core envelope spike nucleocapsid 病毒粒子 virion 成熟的 结构完整 具有侵染力的单个病毒 又称病毒颗粒 virusparticle Capsomereorcapso
10、mer 三类典型形态的病毒 螺旋对称的代表 烟草花叶病毒 TMV 二十面体对称的代表 腺病毒复合对称的代表 T偶数噬菌体 病毒的对称性 三类典型形态的病毒 廿面体对称的结构 球状 螺旋对称的结构 杆状 复合对称的结构 蝌蚪状 大肠杆菌的T偶数噬菌体是由椭圆形的二十面体头部和螺旋对称的尾部组合而成 是病毒中复合对称的代表 病毒粒子的对称体系 螺旋对称 二十面体对称 复合对称 A Filamentous B Complex C Eicosahedral D Enveloped RNAorDNA ProteinCoat Capsomers Lipidenvelope 螺旋对称的病毒粒子 Tobacc
11、oMosaicVirus 二十面体对称病毒粒子 Adenovirus 二十面体对称 刺突tailpins Phaga bacterioohaga 95nm 95nm head neck tail 24环 尾丝 tailfibers 65nm 有囊膜的病毒粒子 Fig 4 VirusObtainingItsEnvelopefromHostCellMembranebyBudding TransmissionElectronMicrographofHIV 1BuddingfromaHostCell 二 毒粒的化学组成 病毒的核酸病毒的蛋白质其它化学成分 脂质 糖类等 一种病毒只含有一种核酸 DNA或
12、RNA 植物病毒绝大多数含DNA 少数含RNA 动物病毒一部分含DNA 一部分含RNA 细菌病毒普遍含DNA 含RNA的极少 病毒的核酸类型极为多样化 病毒的DNA与RNA均有单链和双链 dsDNAssDNAdsRNAssRNA 病毒的核酸 病毒DNA分子有线状和环状之分 病毒核酸有正链 和负链 的区分 规定 将碱基序列与mRNA一致的核酸单链定位正链 将碱基序列与mRNA互补的核酸单链定位负链 因此 就病毒核酸链的单与双以及正和负有以下6种类型 DNA 大部分DNA病毒 RNA 动物呼肠孤病毒 DNA 大肠杆菌 X174噬菌体 RNA 所有单链RNA病毒 大部分植物病毒 DNA 腺病毒 RN
13、A 流感病毒 病毒的核酸 DNA RAN之分 单 双链 singlestrand ss doublestrand ds 之分 环状 线状之分 闭合 开放 正负链之分 病毒的蛋白质 构成病毒外壳 保护病毒核酸免受核酸酶及其他理化因子的破坏 病毒蛋白还构成了病毒组成的酶 决定病毒感染的特异性 与易感细胞表面存在的受体具特异亲合力 促使病毒粒子的吸附 决定病毒的抗原性 并能刺激机体产生相应的抗体 其它化学成分 脂类糖类 原核生物病毒 噬菌体 植物病毒 人类和脊椎动物病毒 昆虫病毒 第四节病毒的复制 一 病毒的复制周期 一步生长曲线以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞 待病毒吸附后 或高倍稀释
14、病毒 细胞培养物 或以抗病毒抗血清处理病毒 细胞培养物以建立同步感染 然后继续培养 定时取样测定培养物中的病毒效价 并以感染时间为横坐标 病毒的感染效价为纵坐标 绘制出病毒特征性的繁殖曲线 即一步生长曲线 一步生长曲线 从一步生长曲线中 可以获得病毒增殖的两个特征性数据 潜伏期和裂解量 潜伏期和裂解量 潜伏期 是毒粒吸附于细胞到受染细胞释放出子代毒粒所需的最短时间 裂解量 是每个受染细胞所产生的子代病毒的平均数目 即等于稳定期病毒效价与潜伏期效价之比 二 病毒的增殖过程 病毒无生长过程 也不以二分裂方式繁殖 只由病毒核酸指令宿主细胞复制大量病毒核酸 继而合成大量病毒蛋白质 最后装配成大量子病毒
15、 并自宿主细胞中释放出来 病毒的增殖过程 病毒的种类繁多 增殖时不同的病毒在细节上有所不同 现以研究最清楚的噬菌体为例作重点说明 噬菌体的增殖一般可以分为五个阶段 吸附 侵入 增殖 装配和释放 原核生物病毒 噬菌体 Thelyticlifecycleconsistsofthefollowingsteps Adsorption Penetration Replication Maturation Release TheLyticLifeCycleofLyticBacteriophages 由于绝大多数噬菌体为蝌蚪形 现以E coliT4为例 介绍蝌蚪形噬菌体的结构 大肠杆菌T4噬菌体构造 偶数噬
16、菌体的形态构造 噬菌体 bacteriophage phage 吸附 指病毒以其特殊结构与宿主细胞表面的特异受体发生特异性结合的步骤 两者发生偶然碰撞后 尾丝的尖端与宿主细胞表面的特异受体接触 尾丝的氨基酸与受体上的羧基形成化学键 就可触发颈须把卷紧的尾丝散开 附着在受体上 从而使刺突 尾板固着于细胞表面 吸附 adsorption 吸附的机理 尾丝尖端与受体发生共价结合 吸附 adsorption 影响因素 噬菌体数量 阳离子 温度 侵入 病毒或其一部分进入宿主细胞的过程 吸附后 基板从尾丝中获得一个构型刺激 促使尾鞘中的144个亚基发生复杂的移位 并缩成原长的一半 由它把尾管推出并插入到细胞壁和膜中 在这一过程中 尾管端所携带的少量溶菌酶有助于局部细胞壁中肽聚糖的溶解 核酸进入 衣壳留在细胞壁外 从吸附到侵入时间很短 侵入 penetration 收缩的尾鞘 1 2环 Thebacteriophagebindstoreceptorsonthebacterialcellwall Thebacteriophageinjectsitsgenomeintothebacterium scyt
