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1、X linkedAgammaglobulinemia BTKgenedefect BriefIntroductionofXLA X连锁无兵种球蛋白血症 X lingkedagammaglobulinemia XLA 又称Bruton无丙种球蛋白血症 是最早发现的人类原发型免疫缺陷病 pomaryimmunodeficiencydisease PID 之一 临床上以反复细菌感染为特征 血清中各类免疫球蛋白明显降低或缺乏 对抗原刺激不能产生抗体应答 血循环中B淋巴细胞减少 淋巴结及淋巴组织缺乏生发中心和淋巴滤泡 骨髓中无浆细胞 但前B淋巴细胞数量正常 T淋巴细胞数量及功能正常 发病原因 BTK属于
2、非受体酪氨酸蛋白激酶 该类激酶泛参与细胞信号传导 影响细胞的存活 增殖和分化 BTK是B细胞发育成熟的关键因素 正常人除T细胞和浆细胞外均有BTK表达 而BTK基因突变只影响B细胞的数量 这说明BTK存B细胞的生长发育过程中起着至关重要的作用 TheStructionofBTKProtein BeginfromNTerminal Thenumberofaminoacid Thelocationofeachexon Btk包含5个结构域 PH结构域 Pleckstrinhomologydomain TH结构域 Techomologydomain SH3结构域 Srchomology3domain
3、 SH2结构域 Srchomology2domain 和催化结构域 Tyrosinekinasedomain 这些结构域可以识别并结合多种信号分子 为Btk参与多种信号通路奠定基础 PH结构域通过识别并结合膜磷脂的代谢产物磷脂肌醇三磷酸将Btk募集到细胞膜上 参与胞外刺激引发的信号转导 7 TH结构域由Btkmotif和富含脯氨酸区域两部分组成 SH3结构域可特异识别TH结构域的富含脯氨酸区域 因此可以发生分子内部的折叠 此外 SH3结构域还可与Syk ZAP70等分子发生相互作用 这对下游的PKC激活有重要作用 BTK突变的分子机制 Btk是许多受体的信号传递所必需的 如B细胞抗原受体 BC
4、R CD38 白介素一5受体 IL 5R 和IL 10R 并作为IL 6和FcaRI信号传递途径的组成部分 而BCR对维持成熟B细胞的数量和对抗原的反应能力是必不可少的 当BCR被交联 crosslinking 后 Btk可以被激活 目前已知 在Btk的信号传导途径中 涉及其上游的Btk激活分子和下游的Btk效应分子两部分 作用于Btk的上游激活分子包括 1 Src家族激酶 研究表明 当BCR交联后 最早发生的事件是激活Src家族激酶 后者可使Btk激酶区中的Y551酪氨酸残基位点磷酸化 导致Btk激酶活性增高和SH3区的Y223酪氨酸残基位点自身磷酸化 进一步对下游效应蛋白产生作用 2 作用
5、于BtkPH区的协同激活分子 通过失功能或获得功能性突变已证明 Btk中的PH区是调节Btk活性的关键区域 结合在BtkPH区的多种蛋白和脂质配体包括异三聚体G蛋白的亚单位 这些分子与BtkPH区相互作用的结果 可促进Btl 的细胞膜定位 使Src家族激酶激活Btk 此外 由于许多PH区的配体涉及G蛋白偶联受体 GPCR 信号 提示Btl 可作为GPCR信号途径的一个成分 与BCR协同或独立于B隙信号途径发挥作用 BTK被上游激活分子激活后 可通过激活多个下游效应分子 发挥复杂的生物效应 包括 1 磷脂酶C PLC 7激活 BCR介导的Ca2 内流和IP3释放 许多实验系统已经证实了Btk具有
6、介导BCR诱导的Ca2 内流作用 BCR交联后可激活Btk 后者可激活PLCy 激活后的PLCy可引起IP 释放和随后的Ca2 内流 2 丝裂原激活蛋白 MAP 激酶通路的激活 Btk可激活C Jun蛋白N端激酶 JNK 和P38 实验研究表明 在BCR缺陷的鸡红细胞或XID及Btk缺陷的鼠中 P38和卟K的活性下降 在Btk的信号通路中 P38和JNK的作用可能是参与调节BCR信号的阈值 3 细胞周期调节和凋亡 调节细胞生存和细胞周期的基因属于Btk信号通路的下游成分 在XID鼠的B细胞中 BCR交联后对抗凋亡基因bcl xl的诱导受损 此外 参与Btk信号通路的相关细胞周期蛋白包括odk2
7、 Odk4 cyclinsD2和A等 4 Btk底物及未知功能的结合伴侣分子 仍有大量的蛋白分子可以在体外与Btk的某些亚区结合 或与Btk免疫共沉淀 或依赖于Btk磷酸化 它们可能是Btk的调节分子或效应分子 但对其功能目前尚缺少直接的实验数据 BTK突变的分子机制 BTK基因拼接点突变致XLA的基因诊断 流式细胞仪检测单核细胞BTK表达 采集患者及其家庭成员肝素抗凝的外周血 密度梯度离心分离外周血单个核细胞 PBMC 使用抗BTK单克隆抗体标记细胞内BTK 流式细胞仪分析PBMc上的BTK表达 基因组DNA和cDNA的制备及其PCR扩增 每人抽取外周血5ml 肝素抗凝 按本实验室常规方法提
8、取基因组DNA和RNA 逆转录合成eDNA 根据基因库 Genbank 中BTK基因组DNA 序列号U78027 及mRNA 序列号X58957 的基因序列 自行设计了18对包括BTK基因19个外显子编码区和侧翼拼接点基因组DNA的PCR引物 3对包括BTKmRNA全长的eDNA引物 进行21次PCR反应 每次反应用0 1 lg基因组DNA或eDNA作为模板 对扩增出的cDNA片段 命名为F M B 进行琼脂糖凝胶电泳分析 比较其各片段的大小 DNA的PCR扩增和序列分析采用PCR直接测序法 用正义 反义两对引物进行双向测序 上述PCR反应产物经乙醇沉淀纯化后 分别以上述引物和含内含子侧翼的内
9、引物 总共21对止义和反义测序引物 用测序试剂盒 PEAppliedBiosystems 直接进行双向测序 所用PCR和测序引物 用ABIPrism377全自动测序仪 测序 BTK基因拼接点突变致XLA的基因诊断结论 单核细胞上BTK蛋白的表达 流式细胞仪测得患儿单核细胞上的BTK蛋白表达为0 同龄对照 母亲和父亲分别为72 42 30 67 58 68 BTKcDNA片段电泳结果 电泳结果显示患儿BTKcDNAM片段的长度较其父母的长约81个碱基 患儿父亲 患儿母亲 患儿的BTKcDNAF M B电泳分析 BTK基因拼接点突变致XLA的基因诊断结论 BTK基因测序结果 患儿BTK基因全基因分
10、析 发现内含子14 2位点碱基替换突变A G IVS14 2 A G 外祖母 母亲BTK基因内含子14 2位点碱基替换A G杂合突变 为携带者 父亲BTK基因正常 BTKmRNA基因分析基因 发现患儿外显子14与15之间拼接异常 分析到异常变大 多81个碱基 的mRNA 母亲 外祖母 父亲外显子14与15之间分析到正常大小tuRNA 这些测序结果与国际遗传免疫缺陷病数据库报道的BTK基因突变类型比较证实为新型的BTK基因突变 A 患儿BTK基因15外显子反向测序结果 内含子14 2位点碱基替换突变A G IVSI4 2 A G B 正常 父亲lBTK基因15外显子反向测序结果 C D 分别为患
11、儿母亲和外祖母的BTK基因15外显子反向测序结果 BTK基因内含子14 2位点硷基替换A G杂合突变 为携带者 E 患儿BTKcDNA反向测序结果 比正常BTKcDNA长81个碱基 F G 分别为患儿父母BTKcDNA反向测序结果 为正常的BTKcDNA XLA的诊断 在年长儿或成人中 低水平的lgG 2 L 和低水平或无IgA IgM是XLA的典型表现 XLA患者血循环中缺乏成熟B细胞 可通过流式细胞攸测定免疫荧光标记的CDl9和 或 CD20B细胞表达抗原 此法对6十月前婴儿诊断尤为重要 预防接种后抗体的检测 接种灭活疫苗后无或产生较弱的抗体 或注入新抗原 噬菌体 Xl74 可发现由于无抗
12、体产生或抗体合成受抑而导致的抗原清除延迟 Btk基因的突变分析是XLA的确诊实验 有关XLA产前检查 因为正常人血循环中的B细胞有两种 1种是来自母亲有活性的x染色体 另1种是来自父亲的有活性的x染色体 而携带者仅有1种来自父亲的有活性的x染色体 来源母亲的x染色体是失活的 X染色体失活型可以通过其甲基化型来检测 即通过连接XLA突变位点临近区多态性或研究杂合子选样性保留的有活性染色体来发现携带者 通过检测突变基因来发现携带者 用连锁分析的方法 如碰用DXSl78作为分子探针 来直接分析 产前分析包括连锁分析和羊水细胞和 或 脐血B淋巴细胞计数的方法 应用基阻序列分析发现携带者亦可为产前诊断提
13、供重要信息 免疫球蛋白替代疗法 治标 IVIG IMIG alloBMT 治本 治疗 IVIG治疗XLA 其起始量一般为400 600m kg 然后根据患儿对治疗的反应束调整用药剂量及给药间隔和频率必领个体化 使免疫球蛋白维持在正常的上限水平 一研究机构比较了不同剂量的IVIG与肌肉注射免疫球蛋白 IMIG 的疗效差别 结果显示每3周接受大剂量IVIG 400mg kg 并保持血清IgG正常或接近正常值低限 4g L 组的患儿住院率 感染率较每3剧接受低剂量IVIG 200mg kg 或IMIG明显减少 早期开始大剂量IVIG治疗的患儿其肺炎 化脓性脑膜炎及胃肠道感染的发生率明显降低 基于这些
14、原困 许多研究中心在婴儿期 生后后6个月 就开始IVIG治疗 免疫球蛋白替代疗法 治标 免疫球蛋白替代疗法缺陷 尽管免疫球蛋白冶疗是XLA的重大进展 但它只能替代IgG而不能建立主动免疫 虽然IVIG可明显降低患儿感染的频率和严重程度 却不能杜绝感染 allo BMT 治本 若不采用替代治疗 约有半数患者在10岁前死亡 采用丙种球蛋白替代治疗 费用昂贵且须替代终生 但是通过异基因骨髓移植 allo BMT 治疗免疫缺陷性疾病 可重建正常的免疫系统 目前为止是根治此病的唯一方法 allo BMT 治本 的讨论及预后 通过allo BMT治疗免疫缺陷性疾病 可重建正常的免疫系统 可以弥补丙种球蛋白
15、替代治疗的缺陷 治疗费用昂贵 且长期应用 患者的依从性差 后重建体液免疫多年健康存活 不再需要替代治疗 生活质量得到明显提高 因此allo BMT治疗是有意义的 预处理有的使用TBI方案 确保Bu有效血药浓度 会出现难以接受的不良反应 但多数是采用改良的BUCY方案 用Bu16 20mg kgCy200mg kg 与这些预处理方案相比 我们采用的预处理方案中 Bu和Cy的量减少 但加用了抗CD3单抗 使得免疫抑制有特异性 因此本预处理方案的清髓作用及不良反应减低 但仍有足够的免疫抑制 可保证异体植活 展望 尽管绝大部分BTK基因突变都可以通过流式细胞仪检测到BTK表达降低 但也有个别存在BTK基因突变的病例BTK表达正常 因此没有检测到BTK蛋白质表达的变化也不能完全排除存在突变的可能 BTK基因的表现型和基因型关系的建立 ThankYouForYourAttention
