《第10章基因诊断GenediagnosisChinaMedi-医学资料》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第10章基因诊断GenediagnosisChinaMedi-医学资料（63页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1,第 10 章 基因诊断 Gene diagnosis China Medical University Department of Medical Genetics,p480,2,本章内容提示,基因诊断概念 基因诊断方法 直接诊断（Southern） 间接诊断（PCR-RFLP） DNA多态 基因诊断 实例：,3,第一节 基因诊断技术 第二节 基因诊断方法及实例,4,基因诊断： 利用分子生物学技术从DNA 水平检测人类遗 传性疾病的基因缺陷，又称DNA分析法。 传统的诊断：表现型基因型 基 因 诊 断：基因型表现型 （ 逆向诊断）,5,基因诊断的特征：,1 不受材料来源影响 外周血、活体穿
2、刺组织、孕妇外周血、血斑等 2 症状前诊断 尤其对于一些延迟显性疾病如Huntingtong舞蹈病 3 产前诊断 避免患儿出生，提高人口质量,6,第一节 基 因 诊 断 技 术,Southern印迹杂交,7,基 因 诊 断 技 术,Northern印迹杂交,8,基 因 诊 断 技 术,斑 点 杂 交,点样,Probe-32P,检测,A B,1 2 3 4,9,基 因 诊 断 技 术,荧光原位杂交,10,基 因 诊 断 技 术,荧光原位杂交,11,基 因 诊 断 技 术,聚合酶链反应,12,基 因 诊 断 技 术,聚合酶链反应,13,基 因 诊 断 技 术, 多重PCR,在一个PCR体系中加入数
3、对PCR引物，覆盖区域不重叠 用于检测同一基因多个外显子的缺失,E1 E2 E3,14,基 因 诊 断 技 术, RT-PCR,以mRNA为模板，经逆转录酶合成cDNA 用于研究基因表达 使微量mRNA迅速扩增，提高mRNA检出的灵敏度,15,基 因 诊 断 技 术, PCR-SSCP （Single Strand Conformation Polymorphism）,单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率的不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。,16,基 因 诊 断 技 术,- primer - 32P-dNT
4、P掺入 PCR扩增 产物 变性 单链DNA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 自显影 1为正常 结果分析 2、4、5为纯合患者 3为杂合子 .,17,基 因 诊 断 技 术,生 物 芯 片,18,第二节 基 因 诊 断 方 法及实例,直接诊断直接检测致病基因的突变 基因突变类型缺失、点突变、重复、插入等,间接诊断应用DNA多态为遗传标记进行连锁 分析，确定待测者是否得到带有致病的染色体，从而间接地作出诊断 DNA多态RFLP、VNTR、SNP,19,一 DNA多态,DNA多态（DNA Polymorphism）： 群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段）存在两种或两种以上的形式，
5、对基因功能没有影响，称DNA多态。 它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标记。,20,DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3类：,1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记； 2）重复序列多态性（VNTR）：如短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记； 3）单碱基多态性（SNP）：DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。,21,一) 限制性片段长度多态性,Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP 由于碱基变异可能导致限制酶切点消失或新的酶切点出现，引起不同个体DNA在用同一限制酶切割时，产生不同长度的DNA片段
6、，称 RFLP RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。,22,Allele II 产生了新的酶切点,Allele I,Allele II,12Kb,8Kb,4Kb,probe,12Kb,8Kb,RFLPSouthern blot检测结果,23,AlleleII酶切位点消失,24,二)数目变异串联重复，variable number tandem repeats, VNTR）,重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态即 VNTR。 散在分布于染色体上。 重复单位625bp长，称为小卫星DNA。 重复单位26
7、bp长，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA。,25,VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。 DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）,26,VNTR 酶切，电泳后的检测结果,大,小,27,PCR-VNTR检测,28,PCR-VNTR,29,30,三)单核苷酸多态性（SNP） （Single Nucleiotide Polymorphism）,SNP：发生在基因组中的单个核苷酸的替代 根据SNP在基因中的位置，分为：
8、 基因编码区SNP 基因周边SNP 基因间SNP 在人类基因组中每100300个核苷酸就有一个SNP,31,二、基诊断方法及实例,直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或邻近DNA序列作为探针，进行Southern 杂交，或通过PCR 扩增产物，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。主要适用于已知基因异常疾病的诊断。,直接基因诊断及实例,32,直接基因诊断 突变型遗传病的直接基因诊断,e.g. 镰形细胞贫血的Gene诊断,33,1）Southern blot 珠蛋白链基因第6位密码子发生突变 GAGGTG 谷Aa缬Aa,e.g. 镰形细胞贫血的Gene诊断,34,已知限制酶Mst 1
9、识别序列 （CCTNAGG） CCTGAGG CCTGTGG 突变后不能识别， 酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。,35,2) ASO探针诊断,已知突变Gene部位和性质，合成寡核苷酸探针，32P标记，进行斑点杂交。 Normal Gene Probe与正常 Probe 杂交稳定 Mutation S Gene Probe与异常 S杂交 稳定,36,等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO） （Allele-specific-oligonucleotide ）,37,斑点杂交结果：,/ /S S/S 正常探针 突变探针,突变型遗传病的直接基因诊断,38,突变型遗传病的直接基因诊断,39,Bam
10、HI,BamHI,2,1,2,10 kb,14 kb,probe,1） 地中海贫血的基因诊断,基因不同程度的缺失可引起不同类型的地中海贫血。,直接基因诊断 缺失型遗传病的直接基因诊断,40,Southern blot 检测结果：,/ /- /- - - /- - - - / - - 正常 缺1 缺2 缺3 缺4,14kb,10kb,缺失型遗传病的直接基因诊断,41,2）地贫的Gene诊断 珠蛋白基因两侧有pst1酶切位点， pst1酶切正常可得到4.4kb片段 珠蛋白基因缺失0.7kb片段， pst1酶切则得到3.7 kb片段为0,缺失型遗传病的直接基因诊断,42,以Gene为探针，South
11、ern blot 方法检测,/A /0 0/0,4.4kb,3.7kb,缺失型遗传病的直接基因诊断,43,3） DMD的基因诊断,DMD属XR DMD基因是最大的基因，有79个外显子 DMD基因突变主要以缺失为主，可涉及基因的不同部位,E1 E2 E3,缺失型遗传病的直接基因诊断,44,病例,外显子,1 2 3 4 5 6 7 8,Pm 3 43 50 13 6 47 60 52,bp,535,113,缺失型遗传病的直接基因诊断,45,二）间接基因诊断方法及实例,当致病基因虽然已知，但其异常性质未知时，或疾病Gene本身尚未知时，主要通过Gene和DNA多态的连锁分析间接地作出诊断。,46,连
12、锁分析基于遗传标记与Gene在染色体上连锁， 通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种遗传标记与疾病的关系，间接推断受检子代是否获得带有致病基因的染色体，间接地判断并做出诊断。 遗传标记是基因组中的DNA 多态 如：RFLP，VNTR 等。,间接基因诊断,47,遗传标记,相关基因,表型分析,间接基因诊断,48,1 Southern blot-RFLP诊断(PKU),PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb 两种等位片段，以PAHcDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交。,间接基因诊断,49,患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的PAH基因与19k
13、b片段连锁 其父、母亲缺陷的PAH基因与19kb片段连锁，其23kb片段与正常PAH基因连锁。 II2为23kb 和19kb片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者。,间接基因诊断,50,2 成年型多囊肾病的诊断,例：成年型多囊肾病APKD，AD ，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。 APKDGene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKD Gene与珠蛋白基因3端附近的一段小卫星DNA序列（3HVR）紧密连锁，因此，可以通过连锁分析进行诊断。,间接基因诊断,51,以3HVR为探针，与P
14、vuII酶切后的家系有关成员的基因组DNA进行Southern Blot,基因组DNA,PvuII酶切,DNA片段,变性,转膜,探针,变性,杂交,结果分析,间接基因诊断,52,1 2 1 2 3 4 5 5.7kb 3.4kb 2.3kb,间接基因诊断,53,结果分析,患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段，说明致病基因与3.4kb片段连锁，并按孟德尔方式遗传。II5不含3.4kb片段，产前诊断正常。,间接基因诊断,54,3 甲型血友病诊断（PCRRFLP）,甲型血友病的基因诊断：已知甲型血友病XR，获得家系成员基因组DNA 。 PCR 142 bp BcLI 142bp 99 bp 43bp 电泳 结果分析,p1,p2,142bp,99bp,43bp,Bcl I,Bcl I -,Bcl I +,间接基因诊断,55,间接基因诊断,
